БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21. № 8, с. 612 - 616
УДК 577.113.6
УДОБНЫЙ НОСИТЕЛЬ ДЛЯ СИНТЕЗА З'-ФОСФАТОВ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
© 1995 г. В. А. Ефимов*, А. Л, Калинкина, О. Г. Чахмахчева
Институт биоорганической химии им. М,М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, 117871, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 8.08.94 г.
Разработан твердофазный способ получения З'-фосфатов олигонуклеотидов на носителе на основе стеклянных шариков, модифицированном алкилсульфонилэтильными группировками. С использованием этих носителей автоматический синтез олигонуклеотидов может проводиться по стандартным методикам и программам, разработанным для амидофосфитного и Н-фосфонатного методов.
Ключевые слова: олигонуклеотиды, твердофазный синтез; 3'-фосфаты; амидофосфитный и Н-фосфонатный методы синтеза.
В настоящее время имеется большая потребность в синтетических олигонуклеотидах, несущих на 3'- или 5'-конце амино-, тиольную, карбоксильную и некоторые другие группировки. В ряде случаев, в частности при химическом лигирова-нии, модификации межнуклеотидных связей или получении меченных флуоресцентными красителями фрагментов нуклеиновых кислот, необходимы олигонуклеотиды с 3'-концевой фосфатной группой [1 - 3]. Известен ряд методов синтеза З'-фосфатов олигонуклеотидов в растворе и на полимерных носителях, которые, однако, не получили широкого распространения ввиду недостатков, связанных как с низкой эффективностью процесса, так и с трудностями при получении соответствующим образом модифицированных полимерных носителей или при работе с ними [4-6]. Наиболее перспективен недавно предложенный носитель на основе тионилированного стекла, модифицированного диметокситритилок-сиэтил-2-меркаптогруппами, который предусматривает удаление готового олигонуклеотида с носителя обработкой дитиотреитом в присутствии аммиака [7].
ж
Недавно нами было показано, что дипента-фторфенилкарбонат является высокоэффективным конденсирующим реагентом в синтезе олигонуклеотидов Н-фосфонатным методом [8]. Кроме того, этот реагент удобен для функционализации полимерных носителей, в частности для присоединения нуклеозид-З'-сукцинатов к аминирован-ному носителю на основе СРв [9]. Ранее нами
Условные обозначения: РРРС - дипентафторфенилкарбо-нат, СРО - шарики из макропористого стекла, СБ - циан-этил, префикс "с1" везде опущен.
*Автор для переписки.
был предложен твердофазный способ синтеза коротких олигомеров в качестве синтонов для фос-фотриэфирного синтеза олигонуклеотидов, основанный на использовании в качестве носителя полистирола, модифицированного сульфонил-этильными группировками [10]. В продолжение этих разработок мы использовали подобную группировку для модификации носителя на основе СРв и исследовали этот носитель в синтезе оли-годезоксирибонуклеотидов амидофосфитным и Н-фосфонатным методами.
В качестве исходного материала был взят ами-нопропил-СРС, который функционализировали способами, показанными на схемах 1 и 2. В обоих случаях использовались диметокситритильные производные алкилсульфонилэтилсодержащих соединений (III) и (VI). Карбоксисодержащее производное (III) получали диметокситритили-рованием этилового эфира (I) с последующим омылением этильной группы и активировали обработкой небольшим избытком РИРС в сухом ацетонитриле или дихлорметане в присутствии триэтиламина (схема 1). В свою очередь, соединение (VI) получали тритилированием бис(2-гидро-ксиэтил)сульфона [11] и превращали его в соответствующий пентафторфениловый эфир обработкой Р№С в присутствии триэтиламина. В обоих случаях пентафторфениловые эфиры (IV) и (VII) образовывались практически с количественным выходом и отделялись от остальных реагентов и образующегося в процессе реакции пентафтор-фенола осаждением пентаном или фильтрацией через небольшую колонку с силика гелем.
Присоединение производных (IV) и (VII) к аминопропил-СРО проводили в диметилформ-амиде или ацетонитриле в присутствии триэтил-
УДОБНЫЙ НОСИТЕЛЬ ДЛЯ СИНТЕЗА З'-ФОСФАТОВ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
613
О О
II ПМТг Cl " ПН ""
HO-CH2CH2-S-CH2-Ç-OC2H5 DMTrO-CH2CH2-S-CH2-C-OC2H,
О О
О О
(I)
(И)
О О
Il NEtj II
DMTr-OCH2CH2-S-CH2-C-(r + PFPC —DMTr-OCH2CH2-S-CH2-C-OC6F3
О О О
О
(Ш)
(7}-nh2
(IV)
DMTr-0-CH2CH2-S-CH2~C
Il i
о о
-NH-(V)
1. н+
2. (DMTr)-Nuc -P(OCE)Ni Pr2, 1 Н-Тетразол
3. Окисление
DMTi—О-! .O
гч" B
0
1
0=P-0CE О I II
o-ch2ch2-s-ch2-c-nh4 p
Il II
о о
1. Нарашиванис олигонуклеотидной цепи
2. Удаление защитных групп
5' HO-Nuc-PNuc-P.....Nuc-P 3'
Nue - нуклеозид
H2N-(P) - аминопропил-CPG
Схема 1.
амина. После промывки непрореагировавшие аминогруппы носителя блокировали обработкой уксусным ангидридом. Анализ CPG показал, что содержание тритильных групп было в пределах 20 - 25 мкмоль/г [8].
Полученные таким образом носители использовали для автоматического синтеза ряда олиго-нуклеотидов, который проводился па синтезаторе фирмы Applied Biosystems (модель 381А) в 0.2, 1 и 10-ми кромольных режимах синтеза стандартным фосфитамидным методом или модифициро-
ванным Н-фосфонатным методом с применением РБРС в качестве конденсирующего реагента [8, 9]. Выходы на каждой стадии элонгации цепи определяли спектрофотометрическим анализом количества удаляемой с носителя димегокситритиль-лой группы. Было показано, что эффективность синтеза олигонуклеотидов на полученных нами носителях столь же высока, как и на обычно используемом аминированном СРв с присоединенным к нему через сукцинильную группировку нуклеозидом. Связь первого З'-нуклеотида с носителем оказалась стабильной как в условиях
О
" DMTr-Cl 11
HO-CH2CH2-S-CH2CH2-OH » DMTr-0-CH2CH2-S-CH2CH20H
(v)
о
(VI)
о
II
-s-
II
о
PFPC, NEt3
О
II-
DMTr -о - сн2сн2 - s -сн2сн2 - о- с- о- c6f5
NH
О
(VII)
о
DMTr-0-CH2CH2-S-CH2CH2-0-C-NH-4 Р
II II
О о
1. н+
2. (DMTr)-Nuc-P(H)OH, PFPC
DMTr-О-1 О
0
1
0=Р-Н
I
о
о-сн2сн2-8-сн2сн2-о-с-ннЧ р о о
1. Наращивание олигонуклеотидной цепи
2. Окисление
3. Удаление защитных групп
5' НО-Нис-Р-Иис-Р-.....Ыис-Р 3'
Схема 2.
межнуклеотидной конденсации, так и при остальных обработках в течение стандартного цикла наращивания цепи (удалении диметокситритиль-ной группы, кэпировании и окислении).
Подобно тому как это описывалось ранее [8, 12], в 5'-конец олигонуклеотид-З'-фосфата могут быть введены различные группировки, например липид или полиэтиленгликоль, а для получения 3',5'-дифосфатов олигонуклеотидов после присоединения последнего нуклеотидного звена может быть проведена дополнительная стадия фосфорилирования.
Олигонуклеотид-З'-фосфаты с носителя после завершения синтеза удаляли действием моноэта-ноламина или гидразина, как это описано ранее [13], или действием концентрированного аммиа-
ка. Полученные таким образом олигонуклео-тиды выделяли электрофорезом в ПААГ, а их гомогенность подтверждали ВЭЖХ. Как можно видеть на рисунке, З'-фосфаты олигонуклеотидов (VIII)-P и (1Х)-Р имели при электрофорезе несколько большую подвижность, чем олигонукле-отиды (VIII, IX) с той же последовательностью оснований без концевых фосфатных групп, синтезированные на стандартных CPG, функцио-нализированных сукцинатами нуклеозидов. Для сравнения подвижности фосфорилированных и нефосфорилированных олигонуклеотидов на электрофорезе использовались 5'-фосфаты олигонуклеотидов P-(VIII) и Р-(1Х), полученные введением фосфатной группы в соединения (VIII) и (IX) с помощью АТР и Т4-полинуклеотидкиназы.
удобный носитель для синтеза з'-фосфатов олигонуклеотидов
615
(а)
Электрофорез в 20% ПААГ, содержащем 7 М мочевину, после удаления защитных групп: а - 15-звенного олигонук-леотида d(ATCGCTTCTGTTACT) (VIII), не содержащего (1,3) и содержащего (2,4) З'-фосфатную группу, полученного Н-фосфонатным (У, 2) и амидофосфитным (3, 4) методом, фотография в УФ-свете после прокрашивания геля этидий-бромидом; б - 14-звенного олигонуклеотида d(CITTCTTTTCTCTT) (IX), полученного Н-фосфонатным методом, с З'-фосфатной группой (3), с 5'-фосфатом, введенным в (IX) с помощью АТР и Т4-полинуклеотидкиназы (1), а также смеси нефосфорилированного олигонуклеотида (IX) и его З'-фосфата (2). Фотография в отраженном УФ-свете.
Таким образом, было показано, что представленные в данной работе носители могут быть с успехом использованы для эффективного синтеза З'-фосфатов олигонуклеотидов амидофосфитным или Н-фосфонатным методами на серийных синтезаторах по стандартным программам. Синтез подобных носителей достаточно прост, и для работы на них не требуется получения специальных производных нуклеозидов, отличных от коммерчески доступных амидофосфитов или Н-фос-фонатов. Кроме того, удаление олигонуклеотида с носителя может проводиться действием аммиака, моноэтаноламина или гидразина, обычно применяемых для этих целей в практике олигонук-леотидного синтеза.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовались: носитель на основе аминопропил-СРО фирмы Ника (50 мкмоль аминогрупп на 1 г); диметокситритилхлорид и бис(2-гид-роксиэтил)сульфон (АШсЬ, США); З'-Н-фосфо-наты и З'-фосфоамидиты дезоксинуклеозидов (МПИрог, США); пиридин, ацетонитрил, дихлор-
метан, диметилформамид, трис (Merck, ФРГ), Т4-полинуклеотидкиназа (Pharmacia, Швеция). Этиловый эфир 2-гидроксиэтилсульфонилуксус-ной кислоты был любезно предоставлен C.B. Ре-вердатто (Пердью Университет, США).
ТСХ проводили на пластинках Kieselgel 60 F254 (Merck, ФРГ). Для обессоливания олигонуклеотидов использовали колонки NAP-10 и NAP-25 (Pharmacia, Швеция), соединения элюировали 0.05 M ТЕАВ.
Карбоксисодержащее производное (III). Этиловый эфир 2-гидроксиэтилсульфонилуксусной кислоты (I) (35 ммоль) вводили в реакцию с диме-токситритилхлоридом (50 ммоль) в 100 мл сухого пиридина. Через 5 - 6 ч в реакционную смесь прибавляли воду и продукт (II) экстрагировали хлороформом. Органическую фазу упаривали, остаток растворяли в 300 мл смеси пиридин-этанол-2 M NaOH (1:3:2). Через 20 мин смесь нейтрализовали добавлением дауэкса-50 (РуН+). Смолу отфильтровывали, промывали 70% водным пиридином. После добавления триэтиламина (10 мл) фильтрат упаривали, остаток растворяли в хлороформе. Целевой продукт (III) выделя
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.