МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 6, с. 667-676
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.873.21:577.113
УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИЙ ПОТЕНЦИАЛ И ГЕНЫ БИОДЕГРАДАЦИИ «-АЛКАНОВ НОВОЙ АЦИДОФИЛЬНОЙ АССОЦИАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ ИЗ СЕРНЫХ КАРТ
© 2014 г. А. Е. Иванова*, х, М. В. Сухачева**, А. Ю. Канатьева***, И. К. Кравченко*, А. А. Курганов***
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва **Центр "Биоинженерия" Российской академии наук, Москва ***Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 06.05.2014 г.
Исследована способность новой аэробной ацидофильной (рост в интервале рН 1.3—4.5 с оптимумом при 2.0—2.5) бактериальной ассоциации AGSi0 из серных карт Астраханского газоперерабатывающего комплекса (АГК) к окислению углеводородов разного химического строения. В сильнокислых средах биодеградации подвергался широкий спектр нормальных (Ci0—C2i) и изо-алканов, толуол, нафталин, фенантрен, а также устойчивые к микробному окислению изопреноиды, пристан и фитан (в составе вазелинового масла), и сильноразветвленный насыщенный углеводород 2,2,4,4,6,8,8-гептаметилнонан. Микробиологические исследования позволили выявить доминирование микобактерий в составе ассоциации AGSi0, что было подтверждено анализом библиотеки клонов генов 16S рРНК. На филогенетическом дереве полученные последовательности генов 16S рРНК формировали отдельную ветвь внутри кластера медленно растущих микобактерий, при этом уровень сходства с геном наиболее близкого вида Mycobacterium florentinum составлял 98%. В геномной ДНК культуры AGSi0 при росте в среде с Ci4—Ci7 н-алканами при рН 2.5 были обнаружены гены двух семейств гидроксилаз, alkB и Cyp153, что может свидетельствовать об их совместном участии в процессе биодеградации углеводородов. Высокий углеводородокисляющий потенциал бактериальной ассоциации AGSi0 свидетельствует о перспективности дальнейшего поиска генов, ответственных за деструкцию различных углеводородов, у ацидофильных микобактерий.
Ключевые слова: накопительная культура, ацидофильные микобактерии, биодеградация нефтяных углеводородов, ПЦР, молекулярное клонирование генов, 168 рРНК, гены а1кВ и Сур153.
DOI: 10.7868/S0026365614060093
Проблеме биодеградации нефтяных углеводородов в экосистемах, экстремальных по одному или нескольким параметрам, уделяется мало внимания. Особенно это касается сильнокислых местообитаний микроорганизмов. Несмотря на то, что процесс окисления углеводородов разных классов зафиксирован в различных природных и природно-техногенных местообитаниях, характеризующихся экстремально низкими значениями рН [1—4], его особенности и разнообразие углево-дородокисляющих прокариот в ацидофильных микробных сообществах остаются малоизученными. По данным Степлтона и соавт. [5], в этих условиях в рассматриваемом процессе основная роль принадлежит эукариотам; в других публикациях [4, 6, 7] отмечается, что бактериальная составляющая микробного сообщества также является ак-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: a.e.ivanova@mail.ru).
тивной. В настоящее время филогенетическое положение определено только у пяти представителей Procaryota, способных к деструкции углеводородов в средах с рН < 4.0, четыре из которых являются представителями родов Acidocella и Acidis-phaera (филум Proteobacteria) [6, 7], а один относится к роду Mycobacterium (филум Actinobacteria) [4].
Физиологические и молекулярные механизмы окисления углеводородов при экстремально низких значениях рН также не выяснены. Сведения об использовании субстратов углеводородной природы ацидофильными бактериями фрагментарны и основаны на результатах тестирования их роста на одном-двух углеводородах одного класса. Попытки выявить гены, кодирующие биодеградацию ароматических (толуол) и полициклических (нафталин) углеводородов и близкие таковым нейтрофильных бактерий, в тотальной ДНК микробного сообщества из кислого местообита-
ния [5] или у гетеротрофных ацидофильных бактерий [7] потерпели неудачу. Единственным примером успешного поиска функциональных генов окисления углеводородов у ацидофильных бактерий является работа [6]. В геноме штамма Acidisphaera sp. C197 при культивировании в среде с н-гексадеканом и рН 4.5 было обнаружено присутствие гена а№В, кодирующего синтез ал-кан-1-монооксигеназы, ключевого фермента окисления алканов. Анализ транслированной аминокислотной последовательности, кодируемой этим ПЦР-продуктом (185 аминокислот), показал сходство последовательности с фрагментом а^В-генов из Xanthobacterflavus (92.5%) и Alkanivorax borkumensis API (89.7%).
Поскольку углеводородокисляющие ацидофи-лы являются потенциальными кандидатами для биоремедиации кислых местообитаний, загрязненных нефтью и нефтепродуктами [8], понимание закономерностей функционирования этих микроорганизмов в природных и техногенных экосистемах, основанное на знании их уникальной физиологии и экологии, необходимо для успешного решения практических задач.
Ранее нами из серных карт АГК было выделено несколько стабильных накопительных культур бактерий, растущих за счет окисления С12—С19 н-алка-нов в средах с экстремально низкими значениями рН (рН < 3.0). Описанная в предыдущей работе [9] бактериальная ассоциация AGS17 была ацидофильной (оптимум рН 2.5) и термотолерантной (рост в диапазоне 20—50°C). По данным ПЦР-ДГГЭ-ана-лиза фрагментов генов 16S рРНК, в ее состав входили бактерии, родственные (98—99% сходства по нуклеотидам) культивируемым представителям экстремально ацидофильных сероокисляющих бактерий двух филумов, Proteobacteria (Acidithio-bacillus) и Firmicutes (Sulfobacillus), а также бактерии с высокой степенью сходства (98%) с медленно растущими актинобактериями, Mycobacterium europaeum и M. parascrofulaceum. Объектом данного исследования служила другая накопительная культура бактерий из серных карт, AGS10.
Целью настоящей работы было изучение способности аэробной бактериальной ассоциации AGS10 к окислению углеводородов разного химического строения, молекулярно-биологический анализ ее микробного разнообразия и поиск генов биодеградации н-алканов при росте в средах с экстремально низкими значениями рН.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Состав сред и условия культивирования. Бактериальную ассоциацию AGS10, выделенную из образца элементной комовой серы в соответствии с процедурой, описанной в работе [9], поддерживали в лабораторной культуре в течение трех лет
(более 30 последовательных пересевов) в жидкой минеральной среде (KCl, 0.1 г/л; (NH4)2SO4, 2.1 г/л; K2HPO4, 0.5 г/л; MgSO4 • 7 H2O, 0.5 г/л; микроэлементы [10], 1 мл/л) со смесью С14—С17 н-алканов (0.5 об. %) в качестве единственного источника углерода и энергии. Начальная величина рН среды составляла 2.0—2.5, температура культивирования 30°C. Культуру инкубировали в статических условиях во флаконах объемом 125—250 мл, герметично закрытых пробками из фторкаучука (Viton stoppers), устойчивыми к воздействию химически агрессивных кислот и углеводородов ("Maag Technic AG", Швейцария), и закрепленных металлическими колпачками. Соотношение объема среды и воздушной газовой фазы составляло 1 : 10, что исключало лимитацию процесса окисления углеводородов по кислороду.
Культуру, выращенную в течение 5—7 сут на углеводородах (0.05 об. %) и отмытую от остаточного углеводорода стерильной средой без субстрата, использовали в качестве инокулята (5 об. %) при изучении роста на разных индивидуальных углеводородах и их смесях.
Рост накопительной культуры AGS10 в средах с малорастворимыми углеводородами, в связи с негомогенным распределением клеток бактерий и их прилипанием к углеводородной фазе, оценивали по изменению оптической плотности OD600 клеточной суспензии в 10 мм кювете на спектрофотометре Ultrospec 2100 pro ("Amersham Biosciences", США) после осаждения биомассы центрифугированием, отмывания свежей средой без субстрата и ресуспендирования клеток в аналогичном объеме среды [9].
Микроскопические исследования. Изучение морфологии клеток, подвижности, окрашивание по Цилю-Нильсену (тест на кислото- и спиртоустой-чивость) проводили согласно стандартным протоколам [11] с использованием светового микроскопа Amplival ("Carl Zeiss", Германия).
Исследование биодеградации нефтяных углеводородов. Заключение об использовании конкретного углеводорода или смеси делали после трех последовательных пересевов культуры AGS10 на тот же субстрат. Все эксперименты ставились в тройной повторности, и отклонение не превышало 10%. В статье приведены результаты типичного эксперимента.
Для оценки биодеградации углеводородов использовали двумерную хроматографическую систему, состоящую из двух газовых хроматографов GC-2010 Plus ("Shimadzu", Япония) с возможностью переключения потока с помощью пневматического переключателя Динса (система "вырезания пика" — heartcut) [12]. Первый хроматограф оборудован пламенно-ионизационным детектором (ПИД), а второй соединен с масс-спектро-метрическим детектором GCMS-QP2010 Ultra с
Таблица 1. Сконструированные праймеры, специфичные для структурных и функциональных генов бактерий рода Mycobacterium
Детектируемый ген Последовательность, 5'—3' Длина ПЦР-фрагмента, п.н.
Cyp153 F -R - GATCCGCTCGCGTGTC GGGAGTGAGGCGAACCA 870
alkB F -R - AGAACSCRCCSGAYGAGG ATRTCRCCGYCRTAGTGC 960
16S рРНК F -R - CATGCAAGTCGAACGGAAA TGTGAAGCCCTGGACATAAG 1170
квадрупольным масс-фильтром. В первом термостате была установлена неполярная капиллярная колонка (SPBTM — 1.60 м х 0.25 мм х 0.25 мкм), во втором — полярная капиллярная колонка (Supel-cowax™ — 10.30 м х 0.25 мм х 0.50 мкм). Температура инжектора составляла 250°C, коэффициент деления потока — 1 : 50, скорость потока газа-носителя через колонку — 1.5 мл/мин. В первом термостате температуру повышали с 50°C (1 мин) до 250°C со скоростью 3°С/мин. Температура во втором термостате была постоянной — 100°С. В качестве газа-носителя использовали гелий класса А.
Обработку хроматограмм осуществляли в рамках программного обеспечения Shimadzu MDGC Solution — 2010 Ver. 2.40.00. Соединения, входящие в состав анализируемых образцов, идентифициро
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.