МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 2, с. 152-159
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 579.22:579.66:547.912
УГЛЕВОДОРОДЫ И МЕТИЛОВЫЕ ЭФИРЫ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
В БИОМАССЕ БАКТЕРИЙ ДО И ПОСЛЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ © 2014 г. И. В. Ботвинко1, О. В. Попова, А. Р. Строева, С. А. Шувалов, В. А. Винокуров
Российский государственный университет нефти и газа имени И.М. Губкина, Москва
Поступила в редакцию 13.12.2012 г.
Методом хроматомасс-спектрометрии идентифицированы углеводороды и метиловые эфиры жирных кислот в экстрактах нативной биомассы хемоорганогетеротрофных бактерий Arthrobacter sp. и Pseudomonas aeruginosa, хемолитоавтотрофной Carboxydothermus sp. Получены доказательства, что ультразвуковая обработка бактерий и мягкий термолиз их биомассы способствуют образованию широкого спектра углеводородов из органического вещества бактерий. В биомассе бактерий (P. aeruginosa) после термолиза при 110°С в открытой емкости идентифицирован биомаркер стигма-стан, относящийся к группе стеранов. Состав алканов в биомассе P. aeruginosa до и после термолиза при 300°С в герметичной емкости оказался одинаков, что указывает на возможность сохранения синтезированных бактериями углеводородов в запечатанных пластах при высокой температуре и повышенном давлении.
Ключевые слова: углеводороды и метиловые эфиры жирных кислот, бактерии, генезис нефти, воздействие ультразвуком и нагреванием.
DOI: 10.7868/S0026365614020037
Углеводороды (УВ) обнаруживаются как в живой, так и неживой природе. В геосфере их основные запасы сосредоточены в залежах нефти и сопутствующего природного газа, в газогидратах, горючих сланцах и каменном угле. В биосфере они синтезируются как эукариотами, так и прокариотами. У эукариот идентифицированы алка-ны, алкены и алкадиены, в том числе полимерные изопреноиды [1—7]. Разнообразны УВ прокариот. Биосинтез метана в природе осуществляют мета-ногенные археи. У архей Thermoplasma sp. и Sul-folobus sp. выявлены арены — алкилбензолы [8]. Бактерии способны к образованию алканов и циклоалканов, алкенов, аренов и алкадиенов, в том числе различных полимерных изопреноидов [2, 3, 9-14].
Безусловно существует связь между источниками УВ в геосфере и биосфере. Разработаны и экспериментально обоснованы две теории происхождения УВ нефти: абиогенная (неорганическая, минеральная) и биогенная (органическая, осадочно-миграционная) [15]. Предполагают, что образование нефти в мантийных очагах в результате неорганического синтеза при термобарических условиях на минералах как катализаторах связано с процессом дегазации Земли и происхо-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: i.v.botvinko@mail.ru).
дило, по всей вероятности, преимущественно до возникновения жизни. В процессе дегазации, главным образом, выделялись Н2, СН4, МН3, Н2О, СО, Н28, С2Н6, СО2, О ее огромных масштабах свидетельствуют запасы газогидратов. Дегазация Земли — один из главных факторов эволюции, создавших на ранних этапах геологической истории гидросферу, атмосферу и, в конечном счете, саму биосферу. После возникновения жизни, по-видимому, начинает преобладать органический наф-тидогенез. Принято считать, что исходным материалом для образования нефти и газа была биомасса фито- и зоопланктона, рассеянная в донных отложениях морей и других водоемов. В процессе их преобразования в осадочные породы происходили превращения находящегося в них органического вещества (ОВ) в высококонденси-рованные макромолекулы — кероген. Созревание керогена сопровождалось постепенным отделением от него УВ компонентов — микронефти. Преобразование ОВ в УВ происходило под воздействием разных источников энергии: повышенного теплового потока, биохимической и химической энергии, радиоактивных минералов вмещающих пород и т.д. Термокаталитическое преобразование ОВ нефтегазоматеринских пород на катагенетической стадии литогенеза (главная
фаза нефтеобразования) происходило при температурах от 60 до 170—180°С [16].
На настоящий момент органическая теория лучше объясняет суть и масштабы формирования нефтяных залежей. В биогенной концепции неф-теобразования прокариотам традиционно отводилась важная роль в начальном преобразовании биомассы эукариот, а также на конечных стадиях миграции нефти во вмещающую породу. Однако к моменту появления эукариот все верхние оболочки Земли уже были преобразованы вследствие биогеохимической деятельности прокариот, продолжающейся и в настоящее время [17]. Поэтому более вероятно, что первоначальный ресурс ОВ для нафтидогенеза обеспечивали прокариоты глубинной биосферы, объем биомассы которой по расчетам составляет половину объема поверхностной [18—20]. Она представлена как археями, так и бактериями и отличается большим разнообразием. Из нефтяных пластов выделены метано-гены и ацетогены, сульфат-, серо-, железо- и мар-ганец-редуцирующие бактерии, а также анаэробные органотрофы [21]. К настоящему моменту сформировались гипотезы, что источником материнского вещества нефти было концентрированное ОВ бактериальных матов и колоний хемоли-тоавтотрофных анаэробных бактерий [18, 19]. По всей вероятности, процессы образования нефти из биомассы остатков прокариотических организмов продолжаются и в настоящее время, учитывая расчетные количества глубинной биомассы и условия формирования нефти.
В связи с вышеизложенным, основной целью работы стало сравнительное исследование УВ в нативной биомассе бактерий и в ОВ биомассы, преобразованном воздействием таких источников энергии, как ультразвук и повышенная температура. Объектами исследования были аэробные бактерии Arthrobacter sp. RV бактерии Pseudomonas aeruginosa RM, способные к анаэробному росту при денитрификации, а также облигатно анаэробные термофильные хемолитоавтотрофные бактерии Carboxydothermus sp. SET-IS9. Последние представляли особый интерес в связи с ранними геологическими этапами накопления ОВ и образования нефти в глубинной биосфере: в качестве единственного источника углерода и энергии данные бактерии используют СО.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. Штамм Carboxydothermus sp. SET-IS9 выделен из горячих источников Исландии в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН, зав. лаб. д.б.н. Е.А. Бонч-Осмоловская. Культивирование этого штамма пресноводных гидрогеногенных СО-окисляющих прокариот проводили при 65°С в течение 48 ч в атмосфере 100% СО в анаэробно
приготовленной жидкой питательной среде следующего состава (г/л): NH4Cl - 1.50, K2HPO4 - 0.50, MgSO4 ■ 7H2O - 0.20, KH2PO4 - 0.10, CaCl2 ■ 2H2O -0.02, NaCl - 0.50; вода дистиллированная; pH 6.0. В среду добавляли 1.0 мл/л раствора витаминов, 1.0 мл/л раствора микроэлементов. В качестве восстанавливающего агента использовали дитио-нит натрия, добавляемый малыми порциями до достижения значения ЕЙ ниже -300 мВ (индикатор резазурин) [22, 23].
Углеводородокисляющие штаммы Arthrobacter sp. RV и Pseudomonas aeruginosa RM выделены из воды рек Волги и Москвы, соответственно, и определены до рода на основании критериев определителя Берджи. P. aeruginosa RM идентифицировали до вида молекулярно-биологическими методами [24]. Бактерии культивировали двумя способами - погруженным и поверхностным. P. aeruginosa RM растили на минерально-органической среде следующего состава, г/л: NaNO3 -2.0; KH2PO4 - 1.0; MgSO4 • 7H2O - 0.25; CaCl2 • ■ 2H2O - 0.01; дрожжевой экстракт - 2.0; глюкоза -20.0; вода дистиллированная; рН 7.0 [25]. Arthrobacter sp. RV выращивали в жидкой среде "rich" следующего состава, г/л: пептон - 2.0, дрожжевой экстракт - 1.0; гидролизат казеина - 1.0; глюкоза -1.0; мел - 2.0; глицерин - 10 мл/л; вода водопроводная; рН 6.7-7.2 [24]. Культивировали штаммы в колбах на круговой роторной качалке (280 об./мин) в течение 24 и 96 ч соответственно. На агаризованной среде (концентрация агара 17.0 г/л) штаммы P. aeruginosa RM и Arthrobacter sp. RV культивировали в чашках Петри при 28°С в течение 24-48 ч. Биомассу Arthrobacter sp. и P. aeruginosa выделяли из жидких культур центрифугированием (центрифуга ОПН-8УХЛ4.2 (Россия), 7000 g, 20 мин), с поверхности плотных сред счищали. Биомассу Carboxydothermus sp. SET-IS9 выделяли из жидкой культуры фильтрованием через капроновые мембраны (НПФ "БИОХРОМ") с размером пор 0.2 мкм.
Термолиз биомассы. Мягкий термолиз биомассы в открытой емкости проводили при значениях температуры 110 и 150°С, соответствующих режиму главной фазы нефтеобразования, по Вассо-евичу [16]. Образцы биомассы (0.5-1 г) в стеклянных бюксах помещали в сушильный шкаф, постепенно нагревали до температуры 110 или 150°С и выдерживали при первом значении 2-3 ч, при втором 1 ч.
Помимо этого, была разработана методика термолиза биомассы бактерий в герметичной емкости. Препарат биомассы высушивали в сушильном шкафу при 80°С до постоянной величины и запаивали в кварцевую ампулу, которую помещали в стальной полый болт и в муфельную печь с ПИД-регулятором. Образцы выдерживали при температуре 300°С в течение 20 ч.
Таблица 1. Состав УВ и их производных в образцах нативной биомассы P. aeruginosa RM, Arthrobacter sp. RV и Carboxydothermus sp. SET-IS9
УВ и производные P. aeruginosa RM Arthrobacter sp. RV Carboxydothermus sp. SET-IS9
Пентадекан С15Н32 + + -
Гексадекан С16Н34 + + +
Октадекан С18Н38 - - +
Нонадецен С^Н^ - - +
Эйкозен С20Н40 - - +
Докозен С22Н44 - - +
2-Бутил-4-диметил-бензилфенол С^Н^О - - +
Метиловый эфир + + +
гексадекановой кислоты С17Н3402
Метиловый эфир + + +
октадекановой кислоты С19Н3802
Метиловый эфир + - -
октадеценовой кислоты С19Н3602
Ультразвуковая (УЗ) обработка биомассы. Биомассу в виде суспензии клеток в фосфатном буфере (рН 7.0) подвергали обработке УЗ (УЗДН-2Т, Россия) с частотой 22 кГц в течение 3 мин по 0.5 мин с интервалом в 1 мин при 20—25°С.
Экстракция и анализ углеводородов. Из образцов нативной, УЗ-обработанной и термолизован-ной биомассы выделяли фракцию гидрофобных веществ экстракцией хлороформом при 25°С на УЗ-ванне при 20°С в течение 15 мин. После удаления растворителя осадок сушили в эксикаторе над CaCl2 и извлекали из него УВ селективной экстракцией н-гексаном в УЗ-ванне при темпе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.