научная статья по теме УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИЕ ПОЛИМЕРЫ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ СТРЕПТОМИЦЕТА-ТЕРМОФИЛА STREPTOMYCES THERMOVIOLACEUS SUBSP. THERMOVIOLACEUS BKM AC-1857T Химия

Текст научной статьи на тему «УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИЕ ПОЛИМЕРЫ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ СТРЕПТОМИЦЕТА-ТЕРМОФИЛА STREPTOMYCES THERMOVIOLACEUS SUBSP. THERMOVIOLACEUS BKM AC-1857T»

БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 7, с. 954 - 960

УДК 577.125

УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИЕ ПОЛИМЕРЫ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ СТРЕПТОМИЦЕТА-ТЕРМОФИЛА ЗЬтерЬвшусея ШегшотоЫсет зиЬэр. ШегшотоЫсет ВКМ Ас-1857т

© 2006 г. Ю.И. Козлова1, Г.М. Стрешинская1*, А.С. Шашков2, С.Н. Сенченкова2, Л.И. Евтушенко3

1 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва; факс: (495)939-4309, электронная почта: streshinskaya@mail.ru

2 Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, 117913 Москва, Ленинский пр., 47; факс: (495)135-5328

3 Всероссийская коллекция микроорганизмов, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, 142292 Пущино Московской обл., пр. Науки, 9; факс: (495)923-3602

Поступила в редакцию 19.01.06 После доработки 21.02.06

Исследованы анионные полимеры клеточной поверхности у стрептомицета-термофила. Обнаружено, что клеточная стенка Streptomyces АегтоуЫаееш виЪвр. АегтоуЫаееш ВКМ Ас-1857т содержит полимеры, различные по структуре: 1,3-поли(глицерофосфат), дисахарид-1-фосфатный полимер с повторяющимся звеном -6)-а-0а1р-(1^6)-а-01срЫАс-Р- и полисахарид без фосфора с повторяющейся единицей ^6)-а-Оа1рМАс-(1^3)-Р-Оа1рЫАс-(1^. В клеточной стенке прокариот впервые описаны установленные структуры дисахарид-1-фосфатного полимера и полисахарида, не содержащего фосфора.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: стрептомицеты, клеточная стенка, анионные полимеры, ЯМР-спектроскопия.

Клеточная стенка микроорганизмов — представителей порядка АсИпотусе1а^, изученных до сих пор, — как правило, характеризуется разнообразием анионных полимеров. К последним относятся, в частности, тейхоевые и тейхуроновые кислоты. Сахар-1-фосфатные полимеры выявлены у некоторых представителей родов этого порядка, реже встречаются углевод-содержащие полимеры без фосфора [1—4]. Общим свойством анионных полимеров является их отрицательный заряд. Кроме того, для клеточных стенок актиномицетов характерно одновременное присутствие нескольких полимеров с различной плотностью отрицательного заряда [1, 5, 6].

Цель настоящего исследования — изучение анионных полимеров клеточной стенки типового штамма термофильного щелочеустойчивого стрептомицета, входящего в обособленную группу рода Streptomyces [7]. Эти микроорганизмы способны расти при повышенной температуре (25—55°) и отличаются от мезофильных стрептомицетов с нумерической и фенетичес-кой точек зрения [7]. С одной стороны, изуче-

* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

ние структур полимеров клеточной поверхности бактерий необходимо для выявления огромного разнообразия этих природных соединений, а с другой стороны, молекулярные исследования особенно важны при определении внутренней таксономии рода.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для изучения был взят типовой штамм термофильного стрептомицета & thermoviolaceus 8иЪ8р. thermoviolaceus ВКМ Ас-1857т Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ). Клетки выращивали в колбах, содержавших 100 мл пептон-но-дрожжевой среды [8] (рН 7,2—7,4), на качалке при 28°. Биомассу для выделения клеточных стенок собирали на стадии логарифмической фазы роста (17—20 ч), отмывали дистиллированной водой и хранили при —20°. После обработки ультразвуком суспензии клеток в водном 0,5%-ном растворе Ds-Na, дальнейшего дифференциального центрифугирования и лиофилизации получали препарат клеточной стенки [9].

Анионные полимеры выделяли из клеточной стенки дробной экстракцией 10%-ной три-

хлоруксусной кислотой (2—3 раза по 24 ч при 4°); индивидуальные полимеры получали методами препаративного электрофореза и гель-хроматографии. Хроматографию и электрофорез выполняли на бумаге FN-13 («Filtrak», ГДР). Разделение фосфорных эфиров, лизина, его производных и полимеров проводили в пиридин-ацетатном буфере 1 (pH 5,5—5,6, 20 В/см, 3—4 ч). Для нисходящей хроматографии на бумаге (БХ) использовали следующие системы растворителей: бутан-1-ол-пиридин-бензол-Н2О (5 : 3 : 1 : 3, по объему) для разделения моносахаридов, полиола; пиридин-этилацетат-Ас0Н-Н20 (5 : 5 : 1 :3, по объему) для разделения аминосахаров, лизина и его производных.

Тейхоевые кислоты и фосфорные эфиры обнаруживали реактивом Ишервуда; моносахариды — анилин-фталатом; полиолы и моносахариды — 5%-ным аммиачным раствором AgNO3; аминосахара, лизин и его амид — нингидрином; гидроксамат лизина — FeCl3 [10]. Суммарный препарат полимеров после автогидролиза при длительном стоянии делили на колонке (75 х 1,8 см) с TSK 40 S гелем («Toyo Soda», Япония), контролируя элюцию 1%-ным АсОН с помощью дифференциального рефрактометра («Knauer», Германия).

Аммонолиз и гидроксиламинолиз клеточных стенок проводили способом, описанным ранее [10], амид лизина и его гидроксамат выявляли путем сравнения со стандартными образцами методом БХ и электрофореза.

Предварительное определение первичной структуры полимеров химическими методами основано на деградации молекулы различными агентами (нагревание с кислотами, щелочью и ферментативный гидролиз), изучении образующихся при этом соединений и восстановления по ним исходного строения изучаемого биополимера.

Кислотный гидролиз полимера проводили 2 М HCl в течение 3 ч при 100° для идентификации фосфорных эфиров, полиолов, моносахаридов, аминосахаров, лизина. Гидролиз дисахарид-1-фосфатного полимера проводили 0,1 М HCl в течение 10 мин и 1 ч при 100°.

Щелочной гидролиз проводили 1 М NaOH 3 ч при 100°, гидролизат обрабатывали Dowex 8 х 50 («Dow», США) (NH^-форма) и лиофилизиро-вали [10].

Спектры ЯМР снимали для 2-3%-ного растворов препаратов в D2O при 30° на спектрометре DRX-500 («Bruker», Германия). Для отсчета химических сдвигов использовали следующие эталоны: — внутренний TSP (натриевая соль 3-(триметилсилил)-3,3,2,2-тетрадейтеропропио-новой кислоты) 8Н 0,0; 13C — внутренний ацетон,

8С 31,45; 31Р — внешнюю (в капилляре) 80%-ную Н3РО4, 8Р 0,0. Двумерные спектры снимали с использованием стандартных методик фирмы «Bruker». Эксперимент НМВС был оптимизирован для КССВ JHC 5 Гц. Время смешивания в эксперименте ROESY составляло 100 мс. Эксперименты 1Н, 13С HMQC были оптимизированы для КССВ 3JH, C 8 Гц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Лиофилизированную клеточную стенку S. ther-moviolaceus subsp. thermoviolaceus ВКМ Ас-1857т обрабатывали трихлоруксусной кислотой, экстракты диализовали против дистиллированной воды и лиофилизировали. При обработке полученных препаратов кислотой (2 M HCl, 3 ч, 100°) в гидролизатах были идентифицированы галактоза, глюкозамин, галактозамин, лизин, глицерин, его моно- и бис-фосфаты. Изучение препаратов с помощью электрофореза в ацетат-но-пиридиновом буфере 1 показало, что они неоднородны и, скорее всего, состоят из нескольких органических фосфорсодержащих соединений (окраска реактивом Ишервуда), движущихся к аноду с подвижностью mGroP 0,79 и 0,47, а также нейтрального компонента, который окрашивался AgNO3.

При аммонолизе и гидроксиламинолизе клеточной стенки S. thermoviolaceus были обнаружены лизин, его амид и гидроксамат, идентифицированные методами БХ и электрофореза путем сравнения со стандартными образцами.

Наборы фосфорных эфиров, нейтральных сахаров и аминосахаров в полученных препаратах были идентичны. В дальнейшем в исследованиях использовали объединенный суммарный препарат.

При гидролизе суммарного препарата (0,1 M HCl, 10 мин, 100°) количество фосфорсодержащих соединений менялось. Содержание соединения с подвижностью mGroP 0,79 преобладало (полимер 1). Соединение с подвижностью mGroP 0,47, видимо, подверглось частичному гидролизу, и количество его уменьшалось (полимер 2). Кроме того, образовывался фосфорный эфир, содержавший галактозу, глюкозамин и фосфор. Увеличение времени гидролиза до 1 ч приводило к увеличению количества этого эфира. Поведение полимера 2 при обработке кислотой предполагало присутствие сахар-1-фосфатных связей [11].

Полимер 1 при кислотном и щелочном (1 М NaOH, 3 ч, 100°) гидролизах образовывал глицерин, его моно- и бис-фосфаты и, следовательно, был поли (глицерофосфатом). Содержание его

было небольшим, поэтому химическими методами не удалось установить к 1,3- или к 2,3-типу он относится [12].

При длительном хранении суммарного препарата в водном растворе (рН 2) полимер 2 подвергался автогидролизу, и методом хроматографии на колонке с TSK-гелем удалось получить две фракции — олигомерную (А) и полимерную (В).

Гидролиз кислотой (2 M HCl, 3 ч, 100°) полимера 3, не содержавшего фосфора, приводил к образованию в качестве продуктов деградации только галактозамина.

Суммарный препарат и полученные фракции были исследованы методами спектроскопии ЯМР. В процессе ЯМР-исследования препарата было замечено, что часть сигналов в спектрах 1Н, 13С и 31Р ЯМР меняет свою интенсивность со временем. На рисунке приведен спектр 13С ЯМР препарата, накопленный при 30° в течение 10 ч. В области резонанса аномер-ных атомов углерода в спектре видны шесть сигналов различной интегральной интенсивности при 102,7, 99,75, 96,45, 95,45, 94,9 и 92,25 м.д. В спектре, снятом через несколько дней, заметно уменьшилась интенсивность сигнала 94,45 м.д. и пропорционально увеличились интенсивности сигналов 96,45 и 92,25 м.д. При стоянии образца в течение месяца при комнатной температуре в его спектре 13С ЯМР практически исчезает сиг-

нал при 95,45 м.д. Это наблюдение позволило нам предположить наличие в препарате лабильного полимера, склонного к автогидролизу, что определило ход спектроскопического исследования препарата. Для свежерастворенного препарата были сняты одномерные (!Н и 13С) и двумерные (COSY, TOCSY, ROESY и HSQC) спектры.

Для олигомерной (А) и полимерной (В) фракций также были сняты перечисленные выше одномерные и двумерные спектры. В спектре 13С ЯМР фракции А в области резонанса ано-мерных атомов углерода наблюдались три сигнала различной интенсивности с химическими сдвигами 99,75, 96,45 и 92,25 м.д., два сигнала в области резонанса атомов углерода, связанных с азотом (55,4 и 58,0 м.д.), две пары сигналов CH3CON (23,4, 23,5 и 175,6, 175,8 м.д. для ме-тильных и карбонильных групп соответственно). В спектре ЯМР 1Н в аномерной области было четыре дублета при 8 4,98 и 4,985 (3J12 4,0 Г

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком