ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 4, с. 477-481
_ ГЕНЕТИКА _
РАСТЕНИЙ
УДК 577.133.1
УГЛЕВОДСВЯЗЫВАЮЩИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЛЕКТИНОВ У КЛЕВЕРОВ Trifalium repens, T. pratense и T. trichocephalum
© 2007 г. И. И. Губайдуллин, Ал. X. Баймиев, Ан. X. Баймиев, А. В. Чемерис
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа 450054; факс: (3472) 35-61-00; e-mail: molgen@anrb.ru Поступила в редакцию 20.01.2006 г.
Секвенированы углеводсвязывающие последовательности (УСП) генов лектинов Trifolium repens, T. pratense и T. trichocephalum. Участки генов, кодирующие УСП лектинов, у T. pratense и T. repens показали заметное сходство, однако сами УСП у этих видов довольно сильно различались, причем на филогенетическом древе, построенном на сравнении нуклеотидных последовательностей и соответствующих им УСП лектинов бобовых, T. repens образует компактный кластер с Melilotus albus и M. officinalis. По аминокислотной последовательности углеводсвязывающего участка лектина и по нуклеотидной последовательности гена лектина T. trichocephalum не входит в группу представителей трибы Trifoleae.
Лектины семейства бобовых имеют высокий уровень сходства как по первичной, так и по третичной структуре при довольно широком диапазоне их специфичности к углеводам [1]. Приблизительно 85% всей последовательности семенных лектинов могут быть отнесены к структурно-консервативным регионам [2]. Более того, различия в специфичности обеспечиваются несколькими конкретными аминокислотными остатками в петлях, составляющих углеводсвязывающий сайт [3-5], и, кроме того, вариациями по длине этих петель, сильно изменяющих структуру связывающего сайта без воздействия на общую трехмерную структуру протомера. Хотя анализ углевод-связывающих сайтов лектинов показал, что некоторые аминокислоты (такие как Arg, Asp, Glu и др.) высококонсервативны, тем не менее какого-то определенного, одного шаблона для установления специфичности не существует, поскольку белки связываются с углеводами разными способами [1]. Однако в строении углеводсвя-зывающих сайтов лектинов ряда растений одной трибы, например, можно обнаружить некоторые закономерности. Так, у манноза/глюкоза (Мап^1с)-специфичных лектинов растений трибы Vicieae в формирование углеводсвязывающих свойств вовлечены следующие остатки: Phe-123, Tyr-124, Asn-125, Ala-126, Ala-127, Trp-128, Thr-28, Ala-33, Ala-30, Glu-31, Asp-81, Gly-97, Gly-98, Gly-99, Tyr-100 (здесь и далее позиция аминокислоты приводится относительно лектина Pisum sativum). У галактоза (Gal)-специфичныx лектинов, в частности Glycine max, вовлечены аминокислоты: Phe-128, Arg-129, Asn-130, Ser-131, Trp-132, Thr-212, Glu-219, Leu-214, Asp-215, Asp-88, His-104, Ala-105, Gly-106, Tyr-107 [6]. Более того, сопоставляя данные по лектинам растений, характеризующимся
известной специфичностью к моносахаридам, с данными по видовому составу ризобий, инфицирующих одинаковые виды растений, обнаружено, что растения с очень схожими углеводсвязываю-щими последовательностями (УСП) лектинов инфицируются одними и теми же ризобиями [7]. В УСП лектинов растений одной группы инокуляции выявлены консервативные, характерные для нескольких групп лектинов, аминокислоты. Эти аминокислоты, часть из которых вовлечена в формирование специфичности к моносахаридам, видимо, определяют и специфичность связывания лектина с ризобиальными рецепторами [8].
В связи с этим представлялось интересным выяснить первичную структуру и провести сравнительный анализ углеводсвязывающих участков лектинов клеверов, входящих в одну группу перекрестной инокуляции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объектов исследования в данной работе использовали бобовые растения клевера белого (Trifolium repens), клевера лугового (Trifolium pratense) и клевера волосистоголового (Trifolium trichocephalum).
ДНК из проростков и листьев растений выделяли фенольно-детергентным методом.
ПЦР проводили на амплификаторе МС2 "Терцик" ("ДНК-технология", Россия) в течение 25-30 циклов по следующей схеме: 94°С, 1 мин (денатурация); 47°С, 1 мин (отжиг праймеров); 72°С, 2 мин (построение цепи ДНК) с использованием стандартных наборов для амплификации ДНК; продолжительность последней стадии составляла 5 мин.
Pisum sativum
Rhizobium leguminosarum bv. viciae
11б 140
va ve fd t fynaawd p SNRDRHigid
Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Trifolium pratense vavefdtfynvewd-tnrdrhigid
Trifolium trichocephalum vavefptyin-qwdpg—fqhigid Trifolium repens vave fdt lhna-wd p-kjgrh i g i d
Melilotus albus Melilotus officinalis Medicago sativa Medicago truncatula
Sinorhizobium meliloti
vavefdtfhna-wd p-jclgrhigid vavefdtfhna-wd p-kjdrhigid vave idtfhnr-wdp-jcjnrh igin va ve id t fz3n г-wd p-kin rh igin
Рис. 1. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей УСП лектинов Trifolium sp. и некоторых других видов бобовых. Аминокислоты, участвующие в связывании ионов металлов, выделены жирным шрифтом; курсивом - аминокислоты, участвующие в формировании углеводной специфичности лектина. Цифрами указаны положения аминокислот в лектине гороха. Дефисами показаны делеции.
Качество и количество выделенных препаратов ДНК определяли с помощью аналитического электрофореза в 1%-ном агарозном геле при напряжении б В/см длины геля. Фрагменты ДНК элюировали из агарозного геля после препаративного электрофореза с помощью легкоплавкой агарозы. Фрагменты клонировали в специально приготовленном векторе pBluescript II KS (-) с выступающими dT-концами. При анализе ре-комбинантных клонов для определения размера вставки применяли быстрый метод щелочного лизиса бактериальных колоний. Все вышеописанные процедуры, а также лигирование ДНК, приготовление компетентных клеток E. coli и трансформацию рекомбинантной ДНК проводили по стандартным прописям, изложенным в лабораторном руководстве Сэмбрук с соавт. [9].
Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе "ABI PRISM 310 Genetic Analyzer" (Applied Biosystems, Inc., США). Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы DNASTAR, Inc. (США). Последовательности лектинов Astragalus falcatus (AJ234379), Astragalus glycyphyllos (AJ234381), Melilotus albus (AJ234392), Melilotus officinalis (AJ234393), Oxytropis pilosa (AJ234395), Pisum sativum (AJ234396), Vicia faba (AJ438593) секвениро-ваны нами ранее и депонированы в международный банк данных GenBank, из которого взяты последовательности лектинов Lathyrus ochrus (P04122), Lathyrus sativum (AJ438594), Lens culinar-is (CAC42124), Lens odemensis (CAC42128), Lens er-voides (CAC42126), Lens nigricans (CAC42127), Medicago sativa l1 (U18296), Medicago sativa l2 (Y16754), Medicago truncatula l1 (X60386), Medicago truncatula l2 (X60387), Medicago truncatula l3 (X82216), Vicia cracca (AJ234399). Из международного банка данных GenBank взяты следующие по-
следовательности внутренних транскрибируемых спейсеров генов рРНК (ITS2) растений: Melilotus officinalis (U50765), Melilotus albus (U50763), Galega officinalis (U50761), Galega orientalis (U56016), Oxytropis pilosa (AF121759), Oxytropis arctica (AF366335), Oxytropis nigrescens (AF366349), Astragalus pulchellus (L10787), Astragalus purshii (L10789), Astragalus falcatus (U50489), Lathyrus transsylvanicus (AY839400), Lathyrus tuberosus (AY839401), Lathyrus vestitus (AY839405), Pisum sativum (AB107208), Vicia cracca (AF335190), Vicia faba (AF335216), Lens lamottei (AJ441067), Lens er-voides (AF228070), Lens nigricans (AF228071), Lens culinaris (AF335222), Lens odemensis (AJ404742), Medicago truncatula (AF028424), Medicago sativa (Z99236), Trifolium lupinaster (AF053163), Trifolium pseudostriatum (AF154599), Trifolium hybridum (AF154600), Trifolium alpinum (AF154603), Trifolium striatum (AF154615), Trifolium pratense (AF154620), Trifolium medium (AF154623), Trifolium repens (AF335224).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В исследованиях роли лектина при становлении бобово-ризобиального симбиоза некоторые представители Trifolium sp. являются по существу модельными растениями. Тем не менее первичная структура генов их лектинов до сих пор не была определена. Нами были секвенированы фрагменты генов лектинов длиной приблизительно по 264 пн у T. repens, T. pratense и T. trichocephalum, включающие в свой состав последовательности, кодирующие углеводсвязывающий домен данных белков и зарегистрированные под номерами DQ319000, Z92673, DQ319001 соответственно.
В нуклеотидных последовательностях этих фрагментов обнаружена открытая рамка считывания, не нарушающаяся по всей длине клонированного фрагмента и не содержащая интронов.
При анализе аминокислотных последовательностей углеводсвязывающего участка лектинов клеверов мы обнаружили между ними заметные различия по консервативным аминокислотам (рис. 1). Если у T. pratense в позиции 124 стоит остаток полярной аминокислоты Tyr, в 127 - отрицательно заряженный остаток Asp, в 134 - положительно заряженный Arg, а в 135 - отрицательно заряженный Asp, то у T. repens в позиции 124 находится положительно заряженный His, в 127 позиции имеет место делеция, в 134 положительно заряженный Lys и в 135 - неполярный Ile. У T. trichocephalum в этих положениях стоят только неполярные аминокислоты.
Из рис. 1 и 2 видно, что УСП лектинов данных клеверов демонстрируют значительно большее сходство с последовательностями других растений, чем между собой. Так, углеводсвязывающий
участок лектина T. repens оказался практически полностью гомологичным таковому M. albus. Лектин T. pratense показал совсем небольшое различие с P. sativum, однако это различие пришлось на консервативные аминокислоты, определяющие углеводспецифичность лектина P. sativum: Ala-126, Ala-127 и Ser-131. Как правило, положение этих консервативных аминокислот в лекти-нах бобовых растений разных групп перекрестной инокуляции совпадает [8]. Из данных литературы известно, что замена Ala-126 на Val, изменяющая углеводсвязывающие свойства лектина гороха PSL (Pisum sativum lectin), приводит к заметному уменьшению числа трансгенных по PSL растений клевера, ин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.