МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2008, том 42, № 2, с. 258-264
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.2:616
УГНЕТЕНИЕ СИНТЕЗА КАЛЬПАИНА С ПОМОЩЬЮ ИНГИБИТОРА E-64d В СЕТЧАТКЕ ГЛАЗА, ПОДВЕРГНУТОГО ИШЕМИИ/РЕПЕРФУЗИИ
© 2008 г. Zhiqing Chen, Ke Yao*, Wen Xu, Renyi Wu
Department of Ophthalmology, 2nd Affiliated Hospital, Medical College, Zhejiang University, Hangzhou, 310009 China
Поступила в редакцию 06.04.2007 г.
Принята к печати 23.05.2007 г.
Исследовали действие E-64d, искусственного селективного ингибитора кальпаина, на синтез каль-паина и кальпастатина в сетчатке глаза крысы после экспериментально вызванной ишемии/репер-фузии (IRI). IRI сетчатки моделировали, повышая внутриглазное давление (до 110 мм ртутного столба) в глазу крысы в течение одного часа. Толщину сетчатки и морфологические изменения в ней определяли гистологически. Уровень синтеза m-кальпаина (одна из изоформ кальпаина) в сетчатке оценивали с помощью иммуногистохимического анализа и вестерн-блотинга. Содержание мРНК m-кальпаина и кальпастатина (эндогенного белкового ингибитора кальпаина) определяли с помощью метода ОТ-ПЦР и рассчитывали соотношение m-кальпаин/кальпастатин. Для оценки действия E-64d на синтез кальпаина 5 мкл раствора E-64d5 (100 мкМ) вводили внутривенно сразу же после повышения давления, что приводило к развитию отека, особенно во внутреннем плекси-формном слое сетчатки. Содержание m-кальпаина повышается через 24 ч после воздействия, и этот эффект угнетается в присутствии E-64d (P < 0.05). Уровни мРНК m-кальпаина и кальпастатина повышаются через 24 и 3 ч после IRI соответственно. Ингибитор E-64d не влияет на уровни этих мРНК (P > 0.05). Отношение между содержанием мРНК m-кальпаина и кальпастатина увеличивается через 6, 24 и 72 ч после IRI, но только через сутки это увеличение приостанавливается под действием E-64d (P < 0.05). Таким образом, ингибитор тормозит повышение уровня m-кальпаина и останавливает увеличение отношения между уровнями мРНК m-кальпаина и кальпастатина в сетчатке крыс после IRI. Кроме того, E-64d уменьшает повреждающее действие IRI на сетчатку. Можно предположить, что ингибитор E-64d защищает сетчатку от индуцированного ишемией апоптоза.
Ключевые слова: ингибитор E-64d, кальпаин, кальпастатин, ишемия/реперфузия глаза.
Inhibition of Calpain Expression by E-64d in the Rat Retina Subjected to Ischemia/Reperfusion Injury, by Zhiqing Chen, Ke Yao*, Wen Xu, Renyi Wu (Department of Ophthalmology, the 2nd Affiliated Hospital of the Medical College, Zhejiang University, Hangzhou, China; *e-mail: xlren@zju.edu.cn). To investigate the effect of E-64d, a selective inhibitor of calpain, on the expression of calpain and calpastatin in rat retina subject to ischemia/reperfusion injury (IRI). An animal model of retinal IRI was set up by increasing the intraocular pressure (110 mmHg) of a rat eye for 1 h. The retinal thickness and morphologic changes were detected by histology. The protein expression of m-calpain (a calpain isoform) in the retina was assessed by immunohistochemistry and Western blot assay. The mRNA of m-calpain as well as calp-astatin (an endogenous protein inhibitor of calpain) in the retina was assessed by RT-PCR, and the ratio of m-calpain/calpastatin was then calculated. To evaluate the effect of E-64d on the expression of calpain, the drug (5 ml of 100 mM) was injected intravitreously immediately after IRI. There were retinal edem-atous changes, particularly in the inner plexiform layer after IRI. The protein expression of m-calpain in the retina was increased 24h after IRI, an effect that was inhibited by E-64d (P < 0.05). The mRNA expression of m-calpain and calpastatin was also increased 24 h and 3 h after IRI, respectively. Neither m-calpain nor calpastatin mRNA expression was influenced by E-64d (P > 0.05). The mRNA ratio of m-calpain to calpastatin was increased at the 6 h, 24 h and 72 h after IRI, and only at 24 h the increase of the ratio of m-calpain to calpastatin was inhibited by E-64d (P < 0.05). In the rat retina of IRI, E-64d inhibits the increase of m-calpain protein expression, as well as the mRNA ratio increase of m-calpain to calpastatin. E-64d also inhibited the retinal damage induced by IRI, suggesting a role for E-64d in the protection of the retinal apoptosis induced by IRI.
Key words: E-64d, calpain, calpastatin, ischemia/reperfusion injury.
Принятые сокращения: IRI (Ischemia Reperfusion Injury) - повреждающее действие ишемии/реперфузии; СКГ - слой клеток ганглия; НС - нуклеарный слой; ФСБ - фосфатно-солевой буфер.
* Эл. почта: xlren@zju.edu.cn
Ишемия сетчатки часто встречается в клинической практике и нередко приводит к ухудшению зрения и слепоте. Эффективного лечения этого состояния нет. Ишемия/реперфузия (Ш1) сетчатки - один из повреждающих патофизиологических процессов, приводящих к нарушению зрения [1]. Для разработки стратегий лечения, направленного на защиту нейронов сетчатки, необходимо понять патофизиологическое действие Ш1 на сетчатку. Исследования показали, что Ш1 вызывает апоптоз в клетках нейроэпителия сетчатки [2-4].
Как и в случае других тканей, о запуске апоптоза в нейронах свидетельствуют повышение экспрессии генов семейства Ьс1-2, в том числе, генов Ьах (проапоптозный) и Ьс1-2 (антиапоптозный), и увеличение соотношения экспрессии Ьах/Ьс1-2, что способствует апоптозу [4]. Для выполнения программы апоптоза необходима активация сериновых про-теаз, включая каспазы [5] и кальпаины [6, 7]. Уровень кальпаинов, представленных, в основном, двумя изоформами - т-кальпаином (активируемым ионами Са2+ в миллимолярных концентрациях) и ц-кальпаином (активируемым ионами Са2+ в микромолярных концентрациях), регулируется эндогенным ингибитором, кальпастатином. Полагают, что активность кальпастатина играет критическую роль в предотвращении кальпаин-зависимого катаболизма в тканях [8]. При увеличении отношения содержания кальпаин/кальпастатин последний расщепляется кальпаином и теряет свою ингибирую-щую активность [9]. Поскольку активность кальпа-ина может быть одним из механизмов повреждения и гибели клеток при Ш1, представляет интерес оценить эффективность подхода к лечению нейродеге-неративных заболеваний, основанного на использовании ингибиторов кальпаина. Ранее показано, что ингибитор Б-64Й - первый проникающий в клетки ингибитор кальпаина [10-12] - способен оказывать мощное нейропротекторное действие путем угнетения кальпаин-зависимого апоптоза нейронов при повреждениях спинного мозга [13, 14]. В случае апоптоза нейронов сетчатки, вызванного Ш1, роль кальпаинов и, тем более, механизм действия E-64d остаются неясными.
Ишемия глаза, возникающая при высоком внутриглазном давлении, часто используется в качестве модели ишемии сетчатки на разных видах животных, в том числе на крысах [1] и кроликах [15]. Высокое давление приводит к глобальной ишемии глаза, затрудняя кровообращение и в сетчатке, и в сосудистой оболочке глазного яблока. Патологические характеристики данной модели и характеристики, наблюдаемые при закупорке центральной артерии сетчатки, практически одинаковы [1, 2]. Мы использовали данную модель для исследования действия ингибитора E-64d на синтез т-кальпаина и кальпастатина в сетчатке глаза крыс после Ш1.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Моделирование IRI сетчатки у животных и схема опыта. Все условия опыта соответствовали Правилам использования животных при изучении глаза и зрения, разработанным Ассоциацией исследователей зрения и офтальмологов (ARVO). Крысы линии Sprague-Dawley (200-300 г) получены из Шанхайского центра лабораторных животных Академии наук Китая. Крыс содержали в стандартных условиях освещения с циклом свет/темнота = 12/12
4 при комнатной температуре (21-24°С). Для того, чтобы исключить возможные дефекты глаза до опыта, проводили микроскопическое исследование глаз каждого животного с помощью щелевой лампы. Крыс анестезировали путем внутрибрюшинно-го введения 10% хлоралгидрата (400 мкг/кг). В переднюю камеру правого глаза вводили иглу № 20, соединенную стандартной трубкой с флаконом для инфузий, содержащим физиологический раствор. Высокое внутриглазное давление (109.7 мм ртутного столба) создавали и поддерживали в течение 1 ч, подняв флакон на высоту 150 см. Для снижения давления иглу из передней камеры глаза удаляли. Крыс забивали и глазное яблоко выделяли через 1, 3, 6, 24 или 72 ч после процедуры. Глазное яблоко промывали физраствором и немедленно иссекали сетчатку для выделения суммарного белка или РНК.
Животных случайным образом распределяли на три группы: IRI, IRI + E-64d и контрольную (нормальные животные без какой-либо обработки). Животным группы IRI + E-64d внутривенно вводили ингибитор E-64d (5 мкл раствора с концентрацией 100 мкМ) сразу же после снижения давления.
Гистологические и иммуногистохимические исследования. Глазное яблоко фиксировали парафор-мальдегидом и заливали в парафин. Получали срезы сетчатки толщиной 5 мкм, которые затем окрашивали гематоксилином-эозином или исследовали иммуногистохимически. В последнем случае, в качестве первых антител, использовали антитела к m-кальпаину ("Maixin Biotechnology", Китай). Имму-ногистохимическое исследование проводили, как описано ранее [5]. Срезы депарафинировали в кси-лене и гидратировали, проводя через серию разведений этанола. После трехкратной отмывки фос-фатно-солевым буфером (ФСБ) срезы обрабатывали нормальной сывороткой козы для блокирования неспецифического связывания. Затем срезы инкубировали с первыми антителами (разведение 1 : 100 в ФСБ) в течение 1 ч, промывали ФСБ три раза по
5 мин, обрабатывали соответствующими вторыми антителами (в разведении 1 : 100-1 : 200) и окрашивали 3,3'-диаминобензидинтетрахлоридом. Препараты тщательно промывали и анализировали под микроскопом DXM 1200C (Nikon 80I).
Экстракция белков сетчатки и вестерн-бло-тинг. Сетчатки собирали и гомогенизировали в растворе для экстракции тканевых белков (Cell
Lysis, "Pierce Biotechnology", США). Гомогенат центрифугировали (12000 об/мин, 10 мин, 4° С). Супернатант собирали и определяли концентрацию белка с помощью на
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.