БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 6, с. 441-445
УДК 577.152; 579.236; 579.841.51
УЛЬТРАСТРУКТУРА ГАЛОБАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ В ОБЛАСТИ ВЫХОДА ИЗ НЕЕ ЖГУТИКОВ
© 2008 г. В. В. Сперанский, Т. М. Новикова, А. Л. Метлина
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. АН. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва;
факс: (495)939-31-81; электронная почта: metlina@belozersky.msu.ru Поступила в редакцию 24.03.2008 г.
После доработки 10.06.2008 г.
На основе серийных и единичных срезов клеток Halobacterium salinarum подробно изучено ранее описанное нами у этого представителя архей внутриклеточное образование. Оно располагается под мембраной вблизи полюсов клеток по обе стороны от дискообразной пластинчатой структуры (ДПС), обнаруженной нами в составе аппарата подвижности Hb. salinarum. Однако имеет отличное от ДПС строение. Морфологические характеристики этой структуры полностью соответствуют имеющимся в литературе описаниям "полярной органеллы" (ПО) бактерий. Структура подвергается цитохимическому окрашиванию при выявлении АТР-азной активности, подобно ПО. Проведено сравнение ПО бактерий и подобной структуры галоархей.
Бактерии и археи представлены двумя отдельными ветвями на древе органической жизни [1]. Несмотря на идентичность внешней морфологии их органелл подвижности (жгутиков), к настоящему моменту стало очевидно, что это различные двигательные системы [2-6]. О структуре и свойствах бактериальных жгутиков (БЖ) имеется достаточно информации [7-10] в отличие от жгутиков архей (ЖА). В частности, о внутриклеточных структурах ЖА не известно практически ничего.
При изучении внутриклеточного структурного компонента ЖА на примере НЬ. заИпагит мы впервые подтвердили предположение, выдвинутое в работе Алама и Остерхельта [11], о возможном присутствии в клетках На1оЬааегшш цитоплазма-тической структуры, объединяющей проксимальные концы их жгутиков [12]. Структура была названа нами дискообразной пластинчатой структурой (ДПС). Одновременно с этим мы обнаружили в области вхождения жгутиков в клетку НЬ. заИ-пагит под цитоплазматической мембраной (ЦМ) новую ранее не идентифицированную у архей структуру, напоминающую "полярную органеллу" (ПО) бактерий [13].
ПО впервые описана у бактерий более 40 лет назад [14]. Эта высокоупорядоченная структура обнаружена у бактерий с одним или несколькими полярно расположенными жгутиками [15-21]. Она
Сокращения: ЖА - жгутики архей; БЖ - бактериальные жгутики; ДПС - дискообразная пластинчатая структура; ЦМ - цитоплазматическая мембрана; ПО -полярная органелла.
имеет характерное строение - уложенные в один слой повторяющиеся глобулярные субъединицы, каждая из которых соединена электронно-плотным мостиком с ЦМ. В составе ПО Sphaerotilus na-tans [22, 23] и Campylobacter jejuni [24] обнаружена сильная положительная реакция при проведении цитохимической локализации АТР-азной активности в интактных клетках. В случае C. jejuni цитохимические данные убедительно подтверждены выделением данной структуры из клетки и характеристикой ее АТР-азы методами ингибиторного и субстратного анализов [24]. Кроме того, по данным иммуноэлектронной микроскопии, полученные к выделенной АТР-азе антитела маркировали область, соответствующую ПО [24]. Результаты этих работ позволили предположить, что ПО представляет собой скопление АТР-аз и играет роль своеобразной внутриклеточной энергетической станции. Однако несмотря на то, что данная структура располагается вблизи области крепления жгутиков в клетках бактерий, прямых доказательств участия ПО в работе БЖ не получено [23].
Обнаружение нами под мембраной клеток Hb. salinarum структуры, похожей на ПО бактерий, нуждалось в более подробном ее исследовании, результаты которого представлены в настоящей работе.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Выращивание микроорганизмов. Клетки получали так, как описано в [25].
Электронная микроскопия. Срезы клеток для электронной микроскопии получали, как описано в [25]. Препараты просматривали и фотографировали в тех же условиях [25].
Локализация АТР-азной активности. Локализацию АТР-азной активности на полюсах клеток Hb. salinarum проводили по методике Таушела [23], являющейся модификацией метода Вахш-тейн-Майзель [26], с необходимыми изменениями, связанными с экстремальной концентрацией NaCl.
Состав инкубационной среды: трис-малеатный буфер (ТМБ) - 40 мМ; MgSO4 - 8 мМ; KCl - 8 мМ; CaCl2 - 2 мМ; АТР - 8 мМ; РЬ(11)-ацетат - 2 мМ. Во все растворы добавляли NaCl до концентрации 4.3 М (250 г/л). Клеточную суспензию (100 мл) центрифугировали при 5000g в течение 10 мин, ресус-пендировали в 5 мл ТМБ и смешивали с 4-кратным объемом инкубационной среды. Инкубацию проводили при 30°С в течение 2 ч, после чего материал промывали какодилатным буфером и подготавливали для электронной микроскопии [25]. Параллельно использовали контроль в отсутствие АТР в инкубационной среде.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Ранее проведенный нами анализ серийных срезов клеток НЬ. заНиагыш обнаружил на их полюсах, наряду с ДПС, входящей в структуру аппарата подвижности данной культуры архей [12], другую сложноорганизованную структуру. На первый взгляд она была похожа ДПС, однако имела совершенно иное строение и локализацию [13]. Наша дальнейшая работа подтвердила полученные результаты. Действительно эта структура подстилает ЦМ с двух сторон от ДПС, не контактируя с ней. Эта вторая, обнаруженная нами на полюсах клеток НЬ. заНиагыш структура имеет отличную от ДПС организацию и соединена с ЦМ регулярно расположенными электронно-плотными мостиками, в основании которых просматриваются отдельные частицы - глобулы. На "тенях" клеток это видно отчетливо (рис. 1). Часто из-за проведенных манипуляций при приготовлении срезов эти структуры выглядели достаточно разрушенными (рис. 2). Однако этот результат интересен как иллюстрация большой устойчивости образований к внешним воздействиям.
Серийные срезы выявляют сложную форму данной структуры, простирающуюся на десятые доли микрометра в продольном и поперечном направлениях вдоль ЦМ, к которой она тесно прилегает. По своей ультраструктуре и расположению в клетке она похожа на известную уже более 30 лет ПО бактерий [14].
Для проверки предположения об идентичности обнаруженной у архей-галофилов обширной суб-плазмалеммной структуры ПО бактерий, а также с целью дальнейшей характеристики самой ДПС проведена цитохимическая локализация АТР-азной активности этих структур по аналогии с работой Таушела [23] с помощью модифицированного метода Вахштейн-Майзель [26]. Суть данного метода состоит в "захвате" ионами свинца неорганического фосфата с образованием нерастворимого гидроксиапатита свинца Pb5(PO4)OH на месте гидролиза АТР. Высокая электронная плотность образующегося осадка наряду с минимальной диффузией позволяет использовать данную процедуру для электронно-микроскопического выявления ферментативной активности. После проведения цитохимической реакции клетки подвергали традиционной обработке для электронной микроскопии.
Были использованы три варианта постановки опыта: 1) с префиксацией глутаровым альдегидом; 2) с префиксацией формальдегидом; 3) без префиксации, когда живые клетки помещали непосредственно в инкубационную среду. Характерный электронно-плотный осадок гидроксиапатита свинца наблюдали в двух последних случаях в местах локализации ПО, но не ДПС. На рис. 3 представлен результат, полученный после краткой префиксации клеток формальдегидом (3%, 5 мин). Отчетливо видна положительная реакция структур ПО и полное отсутствие осадка в области ДПС (рис. 3а,б). В контрольных опытах (рис. 3в) инкубацию проводили в среде без добавления субстрата. Электронно-плотный осадок в этом случае не наблюдали.
В условиях инкубации клеток в среде с АТР после префиксации их глутаровым альдегидом (4%, 5 мин) наблюдали полное отсутствие образования осадка в области ПО. Такая постановка эксперимента оказалась своего рода контролем, исключающим неферментативную природу наблюдаемой реакции.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ПО известна более 30 лет как субплазмалемм-ная структура, встречающаяся у бактерий с полярно расположенными жгутиками. Она имеет характерное строение, сложную пространственную конфигурацию, расположена вблизи полюса клетки, но никогда не простирается в область цитоплазмы непосредственно под жгутиками. В конце 80-х годов установлена АТР-азная природа ПО. С момента открытия этой структуры полагали, что она связана со жгутиковым аппаратом, однако прямые подтверждения не получены [23]. Неудивительно,
что субплазмалеммные структуры, обнаруженные впоследствии у архей, сопоставляли с ПО. Свою роль здесь сыграло и другое ее название - "полярная мембрана", введенное в 1963 г., когда современные представления о структуре мембран еще не утвердились окончательно, и существовало несколько их моделей.
Природа субплазмалеммной структуры, обнаруженной в клетках галоархей наряду с ДПС, требовала уточнения. Кроме того, нельзя было исключать АТР-азную активность и в составе ДПС, что позволило бы рассматривать ДПС как специализацию ПО.
Использовав процедуру цитохимического выявления АТР-азной активности, модифицированную с учетом особенностей экстремальных гало-филов (см. раздел "Экспериментальная часть"), мы получили картину, полностью соответствующую локализации АТР-азной активности ПО в клетках бактерий S. natans [22, 23] и C. jejuni [24]. В нашем случае при большом увеличении даже просматривались характерные детали строения ПО в местах положительной цитохимической реакции. По литературным данным, такое обильное образование осадка с артефактной диффузией в близлежащие участки цитоплазмы указывает на присутствие высокой ферментативной активности, когда могут временно образовываться высокие концентрации фосфата [27]. Для нас наиболее важным обстоятельством было присутствие осадка исключительно на периферии полюса клетки, в местах локализации ПО, но не в районе ДПС.
Процедура цитохимического выявления АТР-азной активности методом Вахштейн-Мазель оказалась своего рода маркером, позволившим разграничить две близк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.