ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 431, № 5, с. 707-710
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 576.341:591.391
УЛЬТРАСГРУКТУРНЫИ АНАЛИЗ ПРОНУКЛЕУСОВ, ИНАКТИВИРОВАННЫХ ЛОКАЛЬНЫМ ЛАЗЕРНЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ ПРИ ЭНУКЛЕАЦИИ ЗИГОТ МЫШЕЙ © 2010 г. Т. А. Свиридова-Чайлахян, О. В. Зацепина, В. И. Попов,
член-корреспондент РАН
Л. М. Чайлахян
Поступило 10.12. 2009 г.
Нами был разработан принципиально новый подход для проведения пересадок ядер у млекопитающих, основанный на энуклеации клеток-реципиентов (ооцитов и зигот) и их слиянии с соматическими клетками (кариопластами) с помощью неинвазивных оптико-лазерных манипуляций [1—3]. Показано, что эффективная энуклеация зиготических зародышей может достигаться однократным облучением пикосекундным импульсом лазера (800 нм) одного из проядрышек последовательно в мужском и женском пронукле-усах. Такое воздействие полностью блокирует дальнейшее развитие зигот на стадии проукле-усов [2]. В то же время при облучении проядрыш-ка только в мужском или только в женском про-нуклеусе зиготы способны к делениям дробления при культивировании in vitro аналогично гино- и андрогенетическим эмбрионам, полученным приемами традиционной микрохирургии [4].
Механизмы остановки развития зигот в результате указанного воздействия лазером на про-ядрышки не ясны. Хотя функциональная роль и структура проядрышек (nucleolar precursor bodies, NPBs) в зародышевых клетках млекопитающих давно и интенсивно изучаются с использованием различных методов, включая их механическое удаление [5], однако, облучение лазером с этой целью до сих пор не применяли. Имеются многочисленные данные по лазерному и ультрафиолетовому облучению ядер соматических клеток млекопитающих [6—10], которые показывают, что ядрышки являются наиболее чувствительным элементом к облучению. Результаты [1—3]
Институт теоретической и экспериментальной биофизики
Российской Академии наук, Пущино Московской обл. Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук, Москва Институт биофизики клетки
Российской Академии наук, Пущино Московской обл.
практически полностью соответствуют этому и свидетельствуют, что проядрышки являются наиболее эффективной мишенью при облучении лазером зародышевых клеток с целью энуклеации.
На различных соматических клетках установлено, что общая морфология и ультраструктура ядрышек могут существенно изменяться после лазерного или УФ-воздействия [6, 7, 9]. Основной причиной этих изменений считают главным образом нарушение метаболизма рРНК, а также белковых компонентов, необходимых для поддержания нормальной структуры ядрышек [6, 8, 9]. Отмечено также, что УФ-облучение зрелых ядрышек пролиферирующих клеток нарушает формирование нормальных ядрышек в ядрах клеток следующего поколения. Образующиеся новые ядрышки ультраструктурно сходны с проядрыш-ками, которые обычно наблюдают при отсутствии синтеза рРНК [6].
Как известно, в начальный период раннего эмбриогенеза млекопитающих, включая стадию зиготы, синтез рРНК отсутствует, а ядрышки, способные к синтезу рибосом и по морфологии аналогичные зрелым ядрышкам соматических клеток, появляются, в частности, у мышей на стадии мо-рулы [11]. В наших опытах облученные лазером проядрышки, а также пронуклеусы и сами зиготы длительное время сохраняют нормальную морфологию, что подтверждается визуальным наблюдением за такими зиготами и окрашиванием пронуклеусов витальным флуоресцентным красителем ДНК Hоechst 33342 [2]. В то же время для выяснения механизма действия лазера представляет значительный интерес изучение этих клеток на ультраструктурном уровне с помощью электронной микроскопии высокого разрешения. В настоящей работе энуклеированные лазером зиготы мышей были исследованы с помощью серийных ультратонких срезов с целью выявления в них возможных структурно-функциональных изменений, вызываемых действием лазера.
Работа выполнена на мышах СВА/Са и С57БЬ/6 (возраст 1.5—2.5 мес). Суперовуляцию
707
9*
708
СВИРИДОВА-ЧАИЛАХЯН и др.
>
ф-:
I • •
1 Хл
J St
Л
%
r •
СЦ'«^
с;
V
V
1 мкм
Рис. 1. Мужской пронуклеус зиготы мыши с одним проядрышком. а — непосредственно перед облучением лазером; б — облучение проядрышка лазером (показано стрелкой); в — сразу после лазерного облучения.
самок C57BL/6 проводили гормонами PMSG (го-надотропин сыворотки жеребых кобыл, "Sigma") и hCG (человеческий хорионический гонадотро-пин, "Sigma") по стандартной методике. Для получения зигот самок C57BL/6 скрещивали с самцами СВА. Зиготы на стадии пронуклеусов выделяли из яйцеводов через 24 ч после введения hCG. Вымывание зародышей проводили с помощью среды М2 ("Sigma"). Для лазерной энуклеации
Рис. 2. Электронная микрофотография мужского пронуклеуса с облученным лазером проядрышком (показано стрелкой).
использовали инвертированныи микроскоп Olympus IX71 (Япония), сопряженный с лазером "Tsunami" ("Laser Spectra Physics", США), работающим в пикосекундном режиме с частотой повторения 80 МГц на длине волны 800 нм, средняя мощность излучения варьировалась в пределах от 0.08 до 0.8 Вт. Зиготы помещали в специальную камеру, изготовленную из покровных стекол, и однократно облучали одно из проядрышек сначала в мужском, а затем в женском пронуклеусе лазерными импульсами мощностью 0.1—0.3 Вт и продолжительностью 0.3 с. Манипуляции проводили в среде М2. После облучения зиготы переносили в фиксатор, содержащий 3% параформ-альдегида, 2.5% глутарового альдегида на 0.1 М Na-какодилатном буфере (pH 7.4). Постфиксацию осуществляли в 1%-ном растворе четырех-окиси осмия на 0.1 М Na-какодилатном буфере (pH 7.4). Затем зиготы обезвоживали в этаноле и 100%-ном ацетоне. Клетки заключали в смолу эпон 812-аралдит М и готовили серийные ультратонкие срезы на ультрамикротоме Ultracut E ("Reichert-Jung", Австрия) с помощью алмазного ножа. Срезы вылавливали на опорные сетки (бленды), покрытые пленкой из Pioloform и контрастировали 2%-ным уранилацетатом в 70%-ном этаноле и цитрате свинца по стандартной методике. Образцы изучали в электронном
УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ПРОНУКЛЕУСОВ
709
Рис. 3. Женский пронуклеус зиготы мыши с несколькими проядрышками. а — до облучения лазером; б — облучение лазером одного наиболее крупного прояд-рышка (показано стрелкой); в — после лазерного облучения.
микроскопе JEOL 1010 (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Обработку изображений проводили по методике [12]. Толщина срезов составляла 60—70 нм.
Следует заметить, что при лазерной энуклеации полностью сохраняются объем и целостность клетки-реципиента, тогда как при традиционной механической энуклеации у млекопитающих генетический материал извлекается из клетки вместе с прилежащей цитоплазмой. Полученные нами результаты электронной микроскопии зигот представлены на рис. 1—4. На рис. 1 показан мужской пронуклеус зиготы до облучения (рис. 1а), в момент облучения лазером проядрышка (рис. 1б) и сразу после облучения (рис. 1в). На рис. 2 представлена электронная микрофотография мужского пронуклеуса зиготы с облученным проядрыш-
Рис. 4. Электронная микроскопия женского про-нуклеуса с проядрышками (указаны стрелками), наиболее крупное из которых было облучено лазером (показано светлой стрелкой).
ком. На рис. 3 показан женский пронуклеус зиготы, содержащий несколько проядрышек разного размера до облучения (рис. 3а), в момент облучения лазером наиболее крупного проядрышка (рис. 3б), и также после лазерного облучения (рис. 3в). На рис. 4 представлена электронная микрофотография женского пронуклеуса зиготы с проядрышками, крупное из которых было облучено. Результаты оптической и электронной микроскопии показывают, что проядрышки после лазерного облучения, а также пронуклеусы сохраняют свою нормальную ультраструктуру, полностью соответствующую обычным зиготам [13, 14]. Различные клеточные органеллы (митохондрии, везикулы и т.д.), располагающиеся в цитоплазме вблизи облученных пронуклеусов и на периферии клетки, также сохраняют свою обычную морфологию.
Проведенный анализ свидетельствует о высокой специфичности действия лазера на клетки, излучение которого (на длине волны 800 нм) в инфракрасной области, очевидно, не вызывает разрушительные фототепловые и фотомеханические эффекты на ультраструктурном уровне. Возможно, воздействие лазера вызывает повреждения ре-гуляторных молекулярных компонентов в составе проядрышек, но они не проявляются на ультраструктурном уровне. Полученные результаты можно сопоставить с данными работы [15], выполненной с помощью лазерной техники на ооцитах человека, в которой, в частности, показано, что при
710
СВИРИДОВА-ЧАЙЛАХЯН и др.
искусственном оплодотворении и переносе мужских гамет с помощью лазера на длине волны 800 нм или 1064 нм никаких повреждений клеток не возникает, даже если плотность энергии облучения очень высока (1010 Дж/см2), деструктивные эффекты отмечены только при лазерном излучении на длине волны меньше 800 нм.
В представленных экспериментах, если в про-нуклеусе содержалось больше одного проядрыш-ка, выбор какого-либо проядрышка для энуклеи-рующего облучения был случайным. Результаты дают основания предполагать, что, по-видимому, каждое из проядрышек (вне зависимости от размера и расположения — в мужском или женском пронуклеусе) содержит ключевые факторы, без которых развитие зародышей млекопитающих не возможно. В современной литературе аналогичные представления до сих пор не высказывали, а основной функцией проядрышек принято считать только участие в формировании зрелых ядрышек [11].
Авторы благодарят Dr. A.E. Chiou, А.В. Карме-няна и И.М. Санталову, способствовавших проведению исследований.
Работа поддержана грантом РФФИ 06—04— 89503 ННС а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Karmenyan A.V., Shakhbazyan A.K., Sviridova-Chaila-khyan T.A. et al. // Mol. Reprod. Develop. 2009. V. 76. № 10. P. 975-983.
2. Шахбазян А. К., Свиридова-Чайлахян Т. А., Карме -нянАВ. и др. // ДАН. 2009. Т 428. № 3. С. 407-410.
3. Шахбазян А.К., Карменян А.В., Свиридова-Чайла-хян Т.А. и др. // ДАН. 2009. Т. 429. № 4. С. 550-553.
4. Barton S.C., Surani M.A., Norris M.L. // Nature. 1984. V. 311. P. 374-376.
5. Ogus
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.