научная статья по теме УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ПРОНУКЛЕУСОВ, ИНАКТИВИРОВАННЫХ ЛОКАЛЬНЫМ ЛАЗЕРНЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ ПРИ ЭНУКЛЕАЦИИ ЗИГОТ МЫШЕЙ Математика

Текст научной статьи на тему «УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ПРОНУКЛЕУСОВ, ИНАКТИВИРОВАННЫХ ЛОКАЛЬНЫМ ЛАЗЕРНЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ ПРИ ЭНУКЛЕАЦИИ ЗИГОТ МЫШЕЙ»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 431, № 5, с. 707-710

КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 576.341:591.391

УЛЬТРАСГРУКТУРНЫИ АНАЛИЗ ПРОНУКЛЕУСОВ, ИНАКТИВИРОВАННЫХ ЛОКАЛЬНЫМ ЛАЗЕРНЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ ПРИ ЭНУКЛЕАЦИИ ЗИГОТ МЫШЕЙ © 2010 г. Т. А. Свиридова-Чайлахян, О. В. Зацепина, В. И. Попов,

член-корреспондент РАН

Л. М. Чайлахян

Поступило 10.12. 2009 г.

Нами был разработан принципиально новый подход для проведения пересадок ядер у млекопитающих, основанный на энуклеации клеток-реципиентов (ооцитов и зигот) и их слиянии с соматическими клетками (кариопластами) с помощью неинвазивных оптико-лазерных манипуляций [1—3]. Показано, что эффективная энуклеация зиготических зародышей может достигаться однократным облучением пикосекундным импульсом лазера (800 нм) одного из проядрышек последовательно в мужском и женском пронукле-усах. Такое воздействие полностью блокирует дальнейшее развитие зигот на стадии проукле-усов [2]. В то же время при облучении проядрыш-ка только в мужском или только в женском про-нуклеусе зиготы способны к делениям дробления при культивировании in vitro аналогично гино- и андрогенетическим эмбрионам, полученным приемами традиционной микрохирургии [4].

Механизмы остановки развития зигот в результате указанного воздействия лазером на про-ядрышки не ясны. Хотя функциональная роль и структура проядрышек (nucleolar precursor bodies, NPBs) в зародышевых клетках млекопитающих давно и интенсивно изучаются с использованием различных методов, включая их механическое удаление [5], однако, облучение лазером с этой целью до сих пор не применяли. Имеются многочисленные данные по лазерному и ультрафиолетовому облучению ядер соматических клеток млекопитающих [6—10], которые показывают, что ядрышки являются наиболее чувствительным элементом к облучению. Результаты [1—3]

Институт теоретической и экспериментальной биофизики

Российской Академии наук, Пущино Московской обл. Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук, Москва Институт биофизики клетки

Российской Академии наук, Пущино Московской обл.

практически полностью соответствуют этому и свидетельствуют, что проядрышки являются наиболее эффективной мишенью при облучении лазером зародышевых клеток с целью энуклеации.

На различных соматических клетках установлено, что общая морфология и ультраструктура ядрышек могут существенно изменяться после лазерного или УФ-воздействия [6, 7, 9]. Основной причиной этих изменений считают главным образом нарушение метаболизма рРНК, а также белковых компонентов, необходимых для поддержания нормальной структуры ядрышек [6, 8, 9]. Отмечено также, что УФ-облучение зрелых ядрышек пролиферирующих клеток нарушает формирование нормальных ядрышек в ядрах клеток следующего поколения. Образующиеся новые ядрышки ультраструктурно сходны с проядрыш-ками, которые обычно наблюдают при отсутствии синтеза рРНК [6].

Как известно, в начальный период раннего эмбриогенеза млекопитающих, включая стадию зиготы, синтез рРНК отсутствует, а ядрышки, способные к синтезу рибосом и по морфологии аналогичные зрелым ядрышкам соматических клеток, появляются, в частности, у мышей на стадии мо-рулы [11]. В наших опытах облученные лазером проядрышки, а также пронуклеусы и сами зиготы длительное время сохраняют нормальную морфологию, что подтверждается визуальным наблюдением за такими зиготами и окрашиванием пронуклеусов витальным флуоресцентным красителем ДНК Hоechst 33342 [2]. В то же время для выяснения механизма действия лазера представляет значительный интерес изучение этих клеток на ультраструктурном уровне с помощью электронной микроскопии высокого разрешения. В настоящей работе энуклеированные лазером зиготы мышей были исследованы с помощью серийных ультратонких срезов с целью выявления в них возможных структурно-функциональных изменений, вызываемых действием лазера.

Работа выполнена на мышах СВА/Са и С57БЬ/6 (возраст 1.5—2.5 мес). Суперовуляцию

707

9*

708

СВИРИДОВА-ЧАИЛАХЯН и др.

>

ф-:

I • •

1 Хл

J St

Л

%

r •

СЦ'«^

с;

V

V

1 мкм

Рис. 1. Мужской пронуклеус зиготы мыши с одним проядрышком. а — непосредственно перед облучением лазером; б — облучение проядрышка лазером (показано стрелкой); в — сразу после лазерного облучения.

самок C57BL/6 проводили гормонами PMSG (го-надотропин сыворотки жеребых кобыл, "Sigma") и hCG (человеческий хорионический гонадотро-пин, "Sigma") по стандартной методике. Для получения зигот самок C57BL/6 скрещивали с самцами СВА. Зиготы на стадии пронуклеусов выделяли из яйцеводов через 24 ч после введения hCG. Вымывание зародышей проводили с помощью среды М2 ("Sigma"). Для лазерной энуклеации

Рис. 2. Электронная микрофотография мужского пронуклеуса с облученным лазером проядрышком (показано стрелкой).

использовали инвертированныи микроскоп Olympus IX71 (Япония), сопряженный с лазером "Tsunami" ("Laser Spectra Physics", США), работающим в пикосекундном режиме с частотой повторения 80 МГц на длине волны 800 нм, средняя мощность излучения варьировалась в пределах от 0.08 до 0.8 Вт. Зиготы помещали в специальную камеру, изготовленную из покровных стекол, и однократно облучали одно из проядрышек сначала в мужском, а затем в женском пронуклеусе лазерными импульсами мощностью 0.1—0.3 Вт и продолжительностью 0.3 с. Манипуляции проводили в среде М2. После облучения зиготы переносили в фиксатор, содержащий 3% параформ-альдегида, 2.5% глутарового альдегида на 0.1 М Na-какодилатном буфере (pH 7.4). Постфиксацию осуществляли в 1%-ном растворе четырех-окиси осмия на 0.1 М Na-какодилатном буфере (pH 7.4). Затем зиготы обезвоживали в этаноле и 100%-ном ацетоне. Клетки заключали в смолу эпон 812-аралдит М и готовили серийные ультратонкие срезы на ультрамикротоме Ultracut E ("Reichert-Jung", Австрия) с помощью алмазного ножа. Срезы вылавливали на опорные сетки (бленды), покрытые пленкой из Pioloform и контрастировали 2%-ным уранилацетатом в 70%-ном этаноле и цитрате свинца по стандартной методике. Образцы изучали в электронном

УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ПРОНУКЛЕУСОВ

709

Рис. 3. Женский пронуклеус зиготы мыши с несколькими проядрышками. а — до облучения лазером; б — облучение лазером одного наиболее крупного прояд-рышка (показано стрелкой); в — после лазерного облучения.

микроскопе JEOL 1010 (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Обработку изображений проводили по методике [12]. Толщина срезов составляла 60—70 нм.

Следует заметить, что при лазерной энуклеации полностью сохраняются объем и целостность клетки-реципиента, тогда как при традиционной механической энуклеации у млекопитающих генетический материал извлекается из клетки вместе с прилежащей цитоплазмой. Полученные нами результаты электронной микроскопии зигот представлены на рис. 1—4. На рис. 1 показан мужской пронуклеус зиготы до облучения (рис. 1а), в момент облучения лазером проядрышка (рис. 1б) и сразу после облучения (рис. 1в). На рис. 2 представлена электронная микрофотография мужского пронуклеуса зиготы с облученным проядрыш-

Рис. 4. Электронная микроскопия женского про-нуклеуса с проядрышками (указаны стрелками), наиболее крупное из которых было облучено лазером (показано светлой стрелкой).

ком. На рис. 3 показан женский пронуклеус зиготы, содержащий несколько проядрышек разного размера до облучения (рис. 3а), в момент облучения лазером наиболее крупного проядрышка (рис. 3б), и также после лазерного облучения (рис. 3в). На рис. 4 представлена электронная микрофотография женского пронуклеуса зиготы с проядрышками, крупное из которых было облучено. Результаты оптической и электронной микроскопии показывают, что проядрышки после лазерного облучения, а также пронуклеусы сохраняют свою нормальную ультраструктуру, полностью соответствующую обычным зиготам [13, 14]. Различные клеточные органеллы (митохондрии, везикулы и т.д.), располагающиеся в цитоплазме вблизи облученных пронуклеусов и на периферии клетки, также сохраняют свою обычную морфологию.

Проведенный анализ свидетельствует о высокой специфичности действия лазера на клетки, излучение которого (на длине волны 800 нм) в инфракрасной области, очевидно, не вызывает разрушительные фототепловые и фотомеханические эффекты на ультраструктурном уровне. Возможно, воздействие лазера вызывает повреждения ре-гуляторных молекулярных компонентов в составе проядрышек, но они не проявляются на ультраструктурном уровне. Полученные результаты можно сопоставить с данными работы [15], выполненной с помощью лазерной техники на ооцитах человека, в которой, в частности, показано, что при

710

СВИРИДОВА-ЧАЙЛАХЯН и др.

искусственном оплодотворении и переносе мужских гамет с помощью лазера на длине волны 800 нм или 1064 нм никаких повреждений клеток не возникает, даже если плотность энергии облучения очень высока (1010 Дж/см2), деструктивные эффекты отмечены только при лазерном излучении на длине волны меньше 800 нм.

В представленных экспериментах, если в про-нуклеусе содержалось больше одного проядрыш-ка, выбор какого-либо проядрышка для энуклеи-рующего облучения был случайным. Результаты дают основания предполагать, что, по-видимому, каждое из проядрышек (вне зависимости от размера и расположения — в мужском или женском пронуклеусе) содержит ключевые факторы, без которых развитие зародышей млекопитающих не возможно. В современной литературе аналогичные представления до сих пор не высказывали, а основной функцией проядрышек принято считать только участие в формировании зрелых ядрышек [11].

Авторы благодарят Dr. A.E. Chiou, А.В. Карме-няна и И.М. Санталову, способствовавших проведению исследований.

Работа поддержана грантом РФФИ 06—04— 89503 ННС а.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Karmenyan A.V., Shakhbazyan A.K., Sviridova-Chaila-khyan T.A. et al. // Mol. Reprod. Develop. 2009. V. 76. № 10. P. 975-983.

2. Шахбазян А. К., Свиридова-Чайлахян Т. А., Карме -нянАВ. и др. // ДАН. 2009. Т 428. № 3. С. 407-410.

3. Шахбазян А.К., Карменян А.В., Свиридова-Чайла-хян Т.А. и др. // ДАН. 2009. Т. 429. № 4. С. 550-553.

4. Barton S.C., Surani M.A., Norris M.L. // Nature. 1984. V. 311. P. 374-376.

5. Ogus

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Математика»