НЕЙРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 2, с. 134-139
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 616.831.33
УМЕРЕННАЯ ГИПОБАРИЧЕСКАЯ ГИПОКСИЯ В РЕЖИМЕ ПОСТКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ ПОВЫШАЕТ ЭКСПРЕССИЮ HIF-1a И ЭРИТРОПОЭТИНА В СА1 ПОЛЕ ГИППОКАМПА КРЫС, ПЕРЕЖИВШИХ ТЯЖЕЛУЮ ГИПОКСИЮ
© 2014 г. О. В. Ветровой*, Е. А. Рыбникова, Т. С. Глушенко, К. А. Баранова, М. О. Самойлов
ФГБУНИнститут физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург
Иммуногистохимическим методом исследована экспрессия регуляторной альфа субъединицы гипоксия индуцибельного фактора (Н!Р-1а) и продукта его гена-мишени протективного цитокина эритропоэтина в СА1 поле гиппокампа крыс в ответ на повреждающую тяжелую гипоксию и тяжелую гипоксию с последующими тремя сеансами посткондиционирования умеренной гипобариче-ской гипоксией. Показано снижение иммунореактивности к исследуемым белкам в гиппокампе крыс в ответ на тяжелую гипоксию. Гипоксическое посткондиционирование с использованием сеансов умеренной гипобарической гипоксии (360 мм рт. ст., 2 ч, трижды с интервалом 24 ч) ап-регу-лировало экспрессию Н1Б-1а и эритропоэтина в нейронах СА1 гиппокампа крыс, переживших тяжелую гипоксию. Результаты свидетельствуют о том, что вызываемая посткондиционированием компенсация постгипоксических повреждений нейронов мозга, очевидно, протекает с активным вовлечением Н1Б-1а и эритропоэтина.
Ключевые слова: гипоксия индуцибельный фактор, эритропоэтин, гиппокамп, тяжелая гипоксия, посткондиционирование умеренной гипобарической гипоксией.
DOI: 10.7868/S1027813314020137
ВВЕДЕНИЕ
Как известно, одним из ключевых факторов адаптации к гипоксическим условиям является гипоксия индуцибельный фактор 1 (HIF-1) [6]. HIF1 — транскрипционный фактор, представляет собой гетеродимер белков HIF-1a и HIF-1ß, имеющих ДНК связывающий спираль-петля-спираль домен, центральный PAS (Per-ARNT-Sim) домен, обеспечивающий гетеродимеризацию и С-терми-нальный трансактиваторный домен. HIF-1a, являясь регулируемой субьединицей, накапливается в условиях гипоксии, тогда как HIF-1ß экспресси-руется конститутивно [7]. В присутствии кислорода HIF-1a гидроксилируется пролил-гидроксила-зой, убиквитинилируется и подвергается протеа-сомной деградации [6, 8]. В условиях гипоксии пролил-гидроксилаза инактивируется, и HIF-1a перестает восприниматься убиквитинлигазой. Это приводит к его накоплению, димеризации с HIF-1ß и транслокации в ядро, где происходит взаимодействие с CREB, РНК полимеразой II, связывание с последовательностью HRE (Hypoxia-Responsive Element) и активация транскрипции ге-
*Адресат для корреспонденции: 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6; тел.: 8(952)2402495; e-mail: vov210292@yandex.ru.
нов-мишеней. Установлено, что Н1Р-1 обеспечивает транскрипцию фактора роста эндотелия сосудов (УБОР), транспортера глюкозы-1 (ОЬиТ1), ферментов пентозофосфатного пути, лактатдегид-рогеназы и цитокина эритропоэтина [4]. В последнее десятилетие интерес исследователей к эритро-поэтину значительно возрос в связи с тем, что этот белок в достаточно высоких концентрациях был обнаружен в нейронах мозга, где, по всей видимости, выполняет множественные нейропротектив-ные функции, не связанные с эритропоэзом [3]. Предполагают, что эритропоэтин, будучи транскрипционной мишенью фактора Н1Р-1а, может играть важную роль в механизмах гипоксическо-го/ишемического повреждения нейронов и его компенсации. В частности, в моделях гипоксии/ишемии показано, что экзогенный эритропоэтин снижает объем повреждений мозга и улучшает его структурно-функциональное состояние [9]. Недавно установлено, что одним из наиболее эффективных методов компенсации последствий гипоксии/ишемии является посткондиционирование (ПостК) — предъявление экстремальных воздействий умеренной интенсивности особям, пережившим тяжелое повреждающее воздействие [17, 18]. В нашей лаборатории был разработан новый, неинвазивный способ ПостК с использова-
нием умеренной гипобарической гипоксии (УГГ) (способ гипоксического посткондиционирования, патент на изобретение № 2437164, 20.12.2011). В экспериментах на крысах было показано, что ПостК трехкратной УГГ эффективно предотвращает индуцируемую тяжелой гипоксией (ТГ) гибель нейронов гиппокампа и неокортекса, нормализует активность гормональной системы и поведение у крыс [1, 13]. В настоящее время информации о конкретных нейрональных механизмах, опосредующих описанный протективный эффект ПостК УГГ, нет. Выдвинуто предположение, что гипоксическое ПостК модифицирует экспрессию белков, играющих важную роль в адаптации мозга к гипоксии. С целью проверки данного предположения в настоящей работе исследовали эффект трехкратного ПостК УГГ на экспрессию регуляторной альфа субъединицы гипоксия инду-цибельного фактора (НШ-1а) и продукта его гена-мишени эритропоэтина в СА1 поле гиппокампа крыс, переживших ТГ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на взрослых крысах-самцах линии Вистар весом 200—250 г. Животные были выращены в стандартных условиях вивария Института физиологии им. И.П. Павлова РАН и содержались в лабораторных условиях при свободном доступе к воде и пище. При проведении экспериментов соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) об использовании животных для экспериментальных исследований. Протоколы опытов были утверждены Комиссией по гуманному обращению с животными Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.
Для создания условий ТГ животных помещали в барокамеру проточного типа, снижали давление до 160—180 мм рт. ст., что соответствует подъему на высоту 11000 м. Длительность воздействия 3 ч. "Подъем" на соответствующую высоту проводили, начиная с 760 мм рт. ст. и далее ступенчато понижали давление на 100 мм рт. ст. каждую минуту до достижения отметки в 180 мм рт. ст. Продув камеры воздухом осуществлялся каждые 20 мин с целью поддержания нормального соотношения газов и избежания гиперкапнии. Примерно 50% животных не выживали в условиях ТГ, соответственно они были исключены из опыта. ПостК осуществляли путем трехкратного воздействия умеренной гипобарической гипоксией длительностью 2 ч, с интервалами 24 ч между сеансами. При этом давление в барокамере составляло 360 мм рт. ст., что соответствует подъему на высоту 5000 м. Первый сеанс осуществлялся через 24 ч после ТГ, поскольку ранее было показано, что это наиболее эффективный режим ПостК [13]. Животные контрольной группы, не подвергавшиеся
гипоксическому воздействию, проходили соответствующие процедуры пребывания в барокамере. Декапитацию животных для взятия головного мозга осуществляли гильотиной через 75 (n = 6) и 96 (n = 6) часов после ТГ и соответственно через 3 (n = 6) и 24 (n = 6) часа после окончания ПостК (на каждой временной точке производился забой крыс контрольной группы). После декапитации вскрывали череп, извлекали мозг, отрезали мозжечок и помещали мозг в фиксатор. Далее образцы ткани мозга обрабатывали согласно стандартному гистологическому протоколу: фиксировали в молекулярном фиксаторе FineFix (разведение: 28 мл фиксатора + 72 мл 96° этанола, Milestone, Italy) в течение 24 ч при температуре 4°C. Затем образцы промывали в проточной воде в течение 2 ч и обезвоживали, проводя через этанол возрастающих концентраций (50° ^ 70° ^ 80° ^ 96° ^ ^ 96° по 1 ч в каждом). На ночь оставляли в бута-ноле. Затем материал проводили через 2 порции ксилола (по 30—40 мин), помещали в парафин (2 смены парафина, по 1 ч в каждой) в термостате при температуре 56°C и изготавливали парафиновые блоки. На ротационном микротоме (Reichert, Austria) изготавливали серийные срезы мозга во фронтальной плоскости толщиной 7 мкм на уровне —2.80 мм от брегмы. Полученные срезы монтировали на предметные стекла, обработанные полилизином.
Далее срезы депарафинизировали в ксилоле (2 смены по 5 мин) и подвергали регидратации в спиртах (96° ^ 96° ^ 96° ^ 70° по 5 мин в каждом). Для оценки экспрессии белков HIF-1a и эритропоэтина использовали иммуногистохими-ческий метод. Основные этапы метода: 1) инкубация с поликлональными кроличьими антителами к HIF-16 и эритропоэтину (Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA, разведение в PBS 1 : 50); 2) инкубация с вторичными биотинилированными антителами (Vectastein ABC kit, Vector Laboratories, Inc, USA, разведение в PBS 1 : 200); 3) инкубация с комплексом авидина с биотинилированной пе-роксидазой (ABC, Vector Laboratories, Inc, USA, разведение реагентов А и В 1 : 100); 4) визуализация реакции с помощью диаминобензидинового кита (DAB substrate kit for peroxidase, Vector Laboratories, Inc, USA, буфер (1 капля), 3,3-диамино-бензидин (2 капли), Н2О2 (1 капля) на 2.5 мл Н2О).
Анализ препаратов проводили с помощью морфометрической установки, состоящей из светового микроскопа Jenaval (Carl Zeiss, Германия), цифровой камеры Baumer CX05c (Baumer Optronic, Германия) и компьютера IBM PC с программным обеспечением ВидеоТест Мастер Морфология (разработка ООО "Видео Тест", Санкт-Петербург). Клетки подсчитывали в поле зрения площадью 460 х 340 мкм (объектив х40). На основании оценки оптической плотности иммунопози-
Рис. 1. Микрофотографии (х40) СА1 поля гиппокампа контрольных крыс (а), через 75 и 96 ч после тяжелой гипоба-рической гипоксии (б, г) и через 3 и 24 ч после окончания посткондиционирования животных, переживших тяжелую гипобарическую гипоксию (в, д). Иммуногистохимическая реакция на Н1Б-1а. Маркер, 100 мкм.
тивные клетки разделяли на 2 класса: слабо- и интенсивно-экспрессирующие, анализировали общее число иммунореактивных клеток (N) и число интенсивно экспрессирующих клеток (Ni). Результаты обрабатывали с помощью пакетов анализа данных STATISTICA 7.0 Stat Soft, Inc и Microsoft Excel'2003, использовали непараметрический критерий Манн—Уитни (Mann—Whitney Uztest). Изменения считали достоверными при p < 0.05. Все результаты представлены в виде среднего арифметического ±SEM (standard error of the mean). Результаты и SEM выражены в процентах от контроля, контроль принят за 100%.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В мозге животных контрольной группы экспрессия HIF-16 выражена слабо. В СА1 поле гиппокампа ни через 75, ни через 96 ч после ТГ не наблюд
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.