ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2013, том 39, № 3, с. 303-319
УДК 577.152.342*1134:577.322.23
УНИКАЛЬНАЯ СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ АТР-ЗАВИСИМЫХ Lon-ПРОТЕИНАЗ ПОДСЕМЕЙСТВА А
© 2013 г. Т. В. Ротанова*, #, Н. И. Дергоусова*, А. Д. Морозкин**
* Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10 ** НИИ Экспериментальной кардиологии ФГУ "РКНПК" Минздравсоцразвития, 121552 Москва, ул. Черепковская 15а Поступила в редакцию 29.11.2012 г. Принята к печати 6.12.2012 г.
Гомоолигомерные ЬопА-протеиназы являются ключевыми компонентами системы контроля качества белков в клетках бактерий и эукариот. Сравнительным анализом первичных и вторичных структур ряда бактериальных и эукариотических ферментов установлена доменная организация общего пула ЬопЛ-протеиназ. Проведена оценка подобия индивидуальных доменов ферментов, выявлены междоменные линкерные зоны, обнаружены области, способные к включению вставочных пептидных фрагментов. Выявлена уникальность ЬопА-протеиназ как ААА+-белков, которые кроме классического ААА+-модуля содержат а-спирализованный домен, аналогичный а-спирализован-ному домену ААА+-1-модуля шаперонов-дезагрегаз С1рВ/№р104 и включающий фрагмент с соПеё-соП-структурой.
Ключевые слова: ААА+-белки, АТР-зависимый протеолиз, ЬопЛ-протеиназы, шапероны С1рВ, первичная и вторичная структура, доменная организация, еоПей-еоП область.
DOI: 10.7868/S0132342313030111
ВВЕДЕНИЕ
LonA-протеиназы — бифункциональные гомоолигомерные эндопептидазы — относятся к суперсемейству ААА+-белков (АТР-аз, ассоциированных с различными клеточными активностями) и являются ключевыми компонентами системы контроля качества белков, поддерживающей сохранность клеточного протеома [1]. АТР-азные ААА+-модули и протеолитические (Р) домены LonA-протеиназ последовательно локализованы в единой полипептидной цепи и совместно участвуют в селективном гидролизе белковых мишеней [2, 3]. ААА+-модули имеют обычную для ААА+-белков организацию и состоят из двух структурных доменов — большего нуклеотидсвязывающе-го (NB-домен) и меньшего а-спирализованного (Н-домен). Они содержат полный набор характеристических для ААА+-белков элементов: кон-сенсусные мотивы Уолкера А и В, SRH-фрагмент, консервативные остатки "sensor-1", "sensor-2" и "аргининовый палец" [4—6]. Р-Домены ферментов, функционирующие в условиях сопряжения с гидролизом АТР и деградирующие белковые субстраты по процессивному механизму [2], принад-
# Автор для связи (тел.: (495) 335-42-22; факс: (495)335-71-03; эл. почта: tatyana.rotanova@ibch.ru).
лежат к классу серин—лизиновых пептидгидролаз [7—9], формирующих семейство S16 клана SJ в классификации MEROPS [10]. Пространственное строение полноразмерных ЬопА-протеиназ до настоящего времени не определено. Вместе с тем, известны кристаллические структуры ряда функциональных фрагментов ферментов: Н- и Р-доменов Ьоп-протеиназы из Escherichia co-li (EcLon) [9, 11], Р-домена митохондриального фермента человека (HumLon) [12], а также фрагмента, включающего ААА+-модуль и Р-домен Ьоп-протеиназы Bacillus subtilis (BsLon) [13].
Характерной особенностью ЬопА-протеиназ, отличающей их как от протеиназ подсемейства ЬопВ, так и от других ААА+-белков, является наличие пролонгированной ^-концевой области, имеющей размер от 300—330 (у бактериальных ферментов) до 420—570 а.о. (у ферментов эукариот) и включающей, согласно предсказанию (http://www.ch.embnet.org), фрагмент последовательности со специфической coiled-coil конфор-мацией (СС-участок) [14, 15]. Роль ^-концевой области в осуществлении АТР-зависимого протео-лиза и/или в поддержании активной структуры ферментов до настоящего времени окончательно не выявлена, а архитектура ЬопА-протеиназ в этой области исследована недостаточно.
- AAA+ module -
(а)
(б)
(в)
BactLon
N nH CC nH NB H
С N area nH CC nH NB H
H1/NB2-linker H2/NB2-linker
ClpB ÇJN ^>(nB1 >|lI1 |fM f|H^<^NB2 ^j-
H2
AAA+-1 module lns
■ AAA+-2 module ■
lns
(г) LonA
Рис. 1. Схемы строения бактериальных (a) и эукариотических (б) Lon-протеиназ, шаперонов ClpB (в) и общего пула протеиназ подсемейства LonA (г).
N — N-домен; N area — N-зона; nN — Л'-концевой сегмент; NB, NB1 и NB2 — нуклеотидсвязывающие домены; nH, Н, Н1 и Н2 — а-спирализованные домены; СС — coiled-coil участок; М — промежуточный coiled-coil домен; Р — протео-литический домен; Ins — вставочный фрагмент; linker — линкерный фрагмент. Пары доменов NB/Н, NB1/H1 и NB2/H2 формируют ААА+-модули.
Недавно предложена концепция [16], представляющая ^-концевую область бактериальных ферментов комбинацией двух доменов — собственно ^-концевого (М-домен, около 120 а.о.) и заключенного между ним и ААА+-модулем а-спирали-зованного домена (пН-домен, около 180 а.о.) (рис. 1а), подобного Н1-доменам молекулярных шаперонов семейства С1рБ/Шр104, содержащих в своей структуре два АТР-азных модуля (класс I ААА+-белков). Уникальная особенность С1рБ/Н8р104-шаперонов по сравнению с другими ААА+-белками состоит в строении их ААА+-1-модуля, в Н1-домен которого между третьей и четвертой а-спиралями внедрен вставочный пропеллероподобный М-домен (около 115 а.о.), образованный четырьмя а-спиралями и имеющий СС-конформацию (рис. 1в) [17].
Обсуждаемые а-спирализованные пН-домены бактериальных ЬопА-протеиназ (далее — пН(СС)-домены) также состоят из восьми а-спиралей, четыре из которых (от четвертой до седьмой включительно) предположительно вовлечены в формирование предсказанного (http://www.ch.embnet.org) СС-участка, как и в Н1-доменах шаперонов [16]. Вопрос о топологическом подобии СС-участков ЬопА-протеиназ и М-доменов С1рБ-шаперонов остается открытым. Тем не менее, есть все основания полагать, что доменная организация бактериальных ЬопА-протеиназ соответствует схеме: М—пН(СС)—МБ—Н—Р [16], при этом междомен-
ные зоны в последовательностях ферментов (линкеры) до настоящего времени не охарактеризованы.
В пользу выдвинутой концепции свидетельствуют результаты определения кристаллической структуры трех фрагментов бактериальных ЬопА-протеиназ. Два фрагмента представляют ^-конце-вые последовательности ферментов — это М-домен ЕсЬоп, преимущественно Р-струкгурированный [18], и фрагмент ЕсЬоп-(1-245), объединяющий М-домен и последующие пять а-спиралей пН(СС)-домена [19]; третий фрагмент, &Ьоп-(246—774), объединяет три С-концевые спирали (от шестой до восьмой) пН(СС)-домена, ААА+-модуль и Р-домен фермента [13]. Таким образом, получено экспериментальное подтверждение существования всех структурных элементов (восьми а-спиралей) пН(СС)-домена, однако, пространственная укладка ЬопА-протеиназ в области этого домена остается не определенной, поскольку ни для одного из представителей подсемейства до сих пор не решена структура полного пН-домена со встроенным в него СС-участком.
В ЬопА-протеиназах эукариот ^-концевые области, предстоящие ААА+-модулям, объединяют ^-концевые зоны (М-зоны), по размеру значительно превышающие М-домены бактериальных ферментов, и пН(СС)-домены, подобные пН(СС)-доменам бактериальных ЬопА-протеи-
Таблица 1. Характеристика использованных при сравнительном анализе LonA-протеиназ
ID, идентификатор в базе данных MEROPS Фермент Источник Номер в базе данных MEROPS Кол-во остатков в субъединице N-Концевой остаток в зрелом ферменте* Локализация каталитических остатков
Ser Lys
LonA-протеиназы бактерий и архей Met1
S16.001, EcLon Escherichia coli, MER000485 784 679 722
LonA y-proteobacteria
peptidases BsLon Bacillus subtilis, bacilli MER000487 774 Met1 677 720
ThthLon Thermus thermophilus, MER006064 795 Met1 683 726
deinococci
BrabLon Brucella abortus, MER004081 812 Met1 689 732
a-proteobacteria
NemeLon Neisseria meningitides, MER011561 820 Met1 696 739
ß-proteobacteria
HepyLon Helicobacter pylori, MER003852 835 Met1 741 784
s-proteobacteria
S16.UPW MemaLon Methanosarcina mazei, MER019389 795 Met1 681 724
archaea
LonA-протеиназы эукариот Pro114
S16.002, HumLon Homo sapiens MER000495 959 855 898
PIM1 RatLon Rattus norvegicus, rodent MER017098 950 Pro102 845 888
peptidases CaeLon Caenorhabditis elegans, MER004130 971 Pro79 878 921
nematoda
DrmLon Drosophila melanogaster, MER011218 1006 Pro82 880 923
fruit fly
SalmLon Salmo salar, fish MER164996 1014 Pro158 919 962
S16.UPW SacLon Saccharomyces cerevisiae, MER000496 1133 Pro172 1015 1058
baker's yeast
MetrLon Medicago truncatula, MER080354 1146 Met103 1044 1087
plantae
* — N-Концевые аминокислотные остатки зрелых форм LonA-протеиназ эукариот идентифицированы согласно работе [20].
наз [16] (рис. 1б). Архитектура М-зон до сих пор до конца не выяснена.
В настоящей работе проведен сравнительный анализ первичных и вторичных структур бактериальных и эукариотических ЬопА-протеиназ, объединенных в группы по семь представителей, с целью уточнения доменной организации всего пула ЬопА-протеиназ, а также для выявления сходства и различий как внутри каждой из групп, так и между группами. Для сопоставления выбраны последовательности, представляющие ферменты из максимально отдаленных источников (табл. 1). Особо следует отметить, что в группу бактериальных ферментов включена ЬопА-про-теиназа из архебактерии (МетаЬоп), хотя еще до недавнего времени считалось, что Ьоп-протеина-зы архебактерий представлены исключительно ферментами подсемейства ЬопВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выравнивание последовательностей анализируемых ЬопА-протеиназ (далее Ьоп-протеиназы,
Lon) и их предсказанных вторичных структур было проведено с учетом экспериментальных данных по вторичной структуре EcLon, &Lon и Hum-Lon, полученных в результате определения кристаллической структуры фрагментов этих белков (индивидуальных доменов или их комбинаций) [9, 11—13, 18, 19]. Результаты выравнивания, представленные на рис. 2, позволили уточнить границы доменов, формирующих полноразмерные ферменты, выявить междоменные линкер-ные зоны, а также обнаружить области, способные к включению вставочных фрагментов. Для оценки степени кон
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.