ГЕНЕТИКА, 2009, том 45, № 11, с. 1506-1515
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 575.853'316.7:576.316.7:582.542.1
УНИКАЛЬНЫЙ ГЕНОМ ДВУХРОМОСОМНЫХ ЗЛАКОВ Zingeria И Colpodium, ЕГО ПРОИСХОЖДЕНИЕ И ЭВОЛЮЦИЯ
© 2009 г. Е. С. Ким1, Н. Л. Большева2, Т. Е. Саматадзе2, Н. Н. Носов1, И. В. Носова2, А. В. Зеленин2, Е. О. Пунина1, О. В. Муравенко2, А. В. Родионов1
ботанический институт им. ВЛ. Комарова Российской академии наук, Санкт-Петербург 197376;
e-mail: avrodionov@mail.ru
2Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва 119991;
e-mail: chrom@eimb.ru Поступила в редакцию 17.04.2009 г.
С помощью методов С-дифференциального окрашивания и двухцветной флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) проведено сравнительное изучение хромосом, выявлена хромосомная локализация генов 45S и 5S рРНК, а также проанализированы последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 генов 45S рРНК в геномах злаков: Zingeria biebersteiniana (2n = 4), Z. pisidica, Z. trichopoda (2n = 8), Colpodium versicolor (2n = 4) и Catabrosella variegata (syn. Colpodium variegatum) (2n = 10). Выявлены различия рисунков С-дифференциального окрашивания хромосом в кариотипах двух образцов Z. biebersteiniana из разных мест произрастания. Установлено сходство рисунков С-бэндинга хромосом 1 и 2 в кариотипах Z. pisidica и Z. biebersteiniana. Картина С-диффе-ренциального окрашивания и локализации генов 45S и 5S рРНК на хромосомах двух видов цингерий подтверждает предположение, что Z. pisidica является аллотетраплоидом, у которого один из субгеномов сходен с геномом Z. biebersteiniana. Сравнение ITS показало, что геномы уникальных двухро-мосомных злаков (x = 2) - Z. biebersteiniana (2n = 4), Z. trichopoda (2n = 8), Z. pisidica (2n = 8) и Colpodium versicolor (2n = 4), относимые ранее к разным трибам или подтрибам сем. Poaceae, представляют два близких рода, генетическое расстояние (p-distance) между ITS которых составляет всего 1.2-4.4%. На молекулярно-филогенетическом древе виды родов Zingeria и Colpodium versicolor образуют единую кладу с Catabrosella araratica (2n = 42, x = 7). Таким образом, установлено, что кари-отипы Zingeria и Colpodium с наиболее низким из известных основным числом хромосом (x = 2) возникли не в разных филогенетических ветвях, а имеют монофилетическое происхождение.
Исследуя эволюцию кариотипов злаков, Г.А. Левитский и сотрудники показали, что редукция хромосомных чисел, наряду с отдаленной гибридизацией и полиплоидизацией, является одной из характерных особенностей кариотипической эволюции злаков. При образовании крупных систематических единиц в пределах семейства Роасе-ае главное значение, по их мнению, имели изменения основного числа хромосом - x (исходное гаплоидное число хромосом у гипотетического диплоидного предка изучаемого таксона, определяемое при сравнительном анализе кариотипов разного уровня плоидности). Роль полиплоидного умножения числа хромосом в общем процессе эволюции кариотипа злаков "не выходила за пределы рода или даже секции рода" [1, 2].
По мнению Н.П. Авдулова, кариотип общего предка злаков содержал 12 пар хромосом. Впоследствии высокие хромосомные числа ^ = 10-13) сохранились у наиболее примитивных групп злаков, в то время как в эволюционно продвинутых трибах в разных филогенетических ветвях произошла редукция основного хромосомного числа до x = 5, 7, 9 [2]. Этот взгляд согласуется с результатами геномных исследований, которые показы-
вают, что общий предок злаков появился около 70 млн. лет назад в результате алло- или автополиплоидного удвоения числа хромосом диплоидного вида (или видов). Структура генома, наиболее близкая к анцестральной, сохранилась, по-видимому, у Sorghum bicolor (сорго) с n = 10 [3-5].
Среди всех злаков наиболее сильная редукция числа хромосом до x = 2 произошла в геномах видов рода Zingeria - Z. biebersteiniana (2n = 2x = 4), Z. kochii (2n = 6x = 12), Z. trichopoda и Z. pisidica (2n = 4x = 8) и у Colpodium versicolor (2n = 2x = 4) [6-15]. Малое число хромосом, их относительно большие размеры и простота идентификации делают вышеперечисленные виды удобными модельными объектами для цитогенетических исследований.
Актуален вопрос о происхождении необычного генома этих злаков, содержащего всего две пары хромосом. В свое время H.H. Цвелёв и З.В. Волховских предположили, что Colpodium versicolor родственен видам рода Zingeria [16]. Однако, с другой стороны, эти же авторы и другие систематики всегда относили эти два рода к разным трибам или подтрибам подсемейства Pooideae [17, 18].
Таким образом, возник вопрос, сформировался ли необычный двухромосомный геном конвер-гентно в разных эволюционных линиях злаков или данный признак появился у общего предка, давшего начало родам Zingeria и Colpodium. Недавно Коцеруба с соавт. [13, 14] c помощью GISH-гибридизации показали, что тетраплоидный вид
Z. pisidica1 является аллотетраплоидом, один из субгеномов которого сходен с таковым у Z. bie-bersteiniana, однако происхождение второго субгенома Z. pisidica пока неизвестно.
Представители родов Zingeria и Colpodium цито-генетически мало изучены. Исключение составляет Z. biebersteiniana, кариотип которой исследовался с помошью C- и Q-дифференциального окрашивания, FISH и иммуноцитохимии [8, 9, 11, 12]. С помощью FISH исследована локализация генов 5S и 45 S рРНК в кариотипах Z. biebersteiniana, Z. pisidica и Colpodium versicolor [12-14]. Выделены и охарактеризованы высокоповторяющиеся последовательности ДНК прицентромерного гетерохроматина Z. biebersteiniana, исследовано их распределение по длине хромосом Z. biebersteiniana и Z. pisidica [14, 19].
В настоящей статье представлены результаты сравнительного молекулярно-цитогенетического и молекулярно-филогенетического исследования геномов Z. biebersteiniana (Claus) P. Smirn. (2n = 4) и Z. pisidica (Boiss.) Tutin (2n = 8), Colpodium versicolor (Stev.) Schmalh. (2n = 4) и Catabrosella varie-gata (Boiss.) Tsvel. (syn. Colpodium variegatum Boiss. ex Griseb.) (2n = 10) c помощью методов С-окрашивания хромосом, FISH c пробами 5S и 45S рДНК и анализа последовательностей ITS1 и ITS2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования хромосом послужили два образца Z. biebersteiniana (2n = 2х = 4), собранные в Волгоградской области (Россия) на лимане Пришиб (окр. пос. Александровка Быковского р-на) и в окрестностях с. Рахинка Дубовского р-на; два образца Z. pisidica (2n = 2х = 8), собранные в Ехе-гнадзорском р-не Армении, в окр. г. Джермук на высоте 1470 м над уровнем моря (А. Гукасян) и в Амассийском районе Армении вблизи оз. Арпалич на высоте 2100 м над уровнем моря (Э. Габриэлян); Colpodium versicolor (2n = 2х = 4) - собранный на Кавказе в Теберде, ущелье Назылыкол (Карачаево-Черкесия, Россия); Catabrosella variegata (syn. Colpodium variegatum (2n = 2x = 10), собранный в Теберде, ущелье Кышкаджер, на высоте 2800 м над уровнем моря (А.В. Родионов, Е.О. Пунина, В.В. Бондаренко, Ю.М. Пунин). Для анализа ITS по-
1 Авторы полагали, что исследуют Z. trichopoda, однако, судя по происхождению исследованного материала (Армения), они изучали Z. picidica — вид, близкий Z. trichopoda (Цвелёв Н.Н. — личное сообщение).
следовательностей кроме ДНК вышеперечисленных образцов растений использовали ДНК гербар-ного образца Z. trichopoda (Boiss.) P. Smirn. -FJ196301, собранного 5-6.07.1916 г. в Грузии: Тифлис, Горийский р-н, между горой Цхра-Цхаро и Тибисцхурским озером (собр. и опр. П.Н. Крылов, Е.И. Штейнберг) и образец Catabrosella araratica (Lipsky) Tzvel., собраный в Армении, Гекакурник-ский р-н, 2300 м над уровнем моря (Э. Габриэлян).
Приготовление хромосомных препаратов, С-окрашивание и FISH с последовательностями рибосомных генов проводили по описанным ранее методикам [20-23].
В качестве зондов для выявления рибосомных генов использовали плазмиду pTa71, содержащую полную ДНК последовательность гена 45S рРНК пшеницы [24], и плазмиду pTa794, содержащую ген 5S рРНК пшеницы [25]. ДНК проба, содержащая теломерные повторы растений, была синтезирована с помощью ПЦР [26].
Хромосомные препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Olimpus BX-61, оборудованного черно-белой CCD-камерой Cool Snap Ropper Scientific. Для обработки полученных изображений использовали компьютерные программы Adobe Photoshop CS ("Adobe Inc.", США) и "Карио 1.5" (ВидеоТест, Санкт-Петербург). Изучали не менее 15 полных метафаз-ных пластинок каждого образца, в которых хромосомы находились в оптимальном интервале компактизации [27].
Выделение геномной ДНК из тканей растений проводили по методике Дойла и Дойл [28] c незначительными модификациями [29]. Для амплификации использовали праймеры ITS 1F [30], ITS 1P [31] и ITS4 [32]. Условия амплификации были описаны ранее [33]. Выравнивание полученных последовательностей выполняли вручную и с помощью программы Clustal W, входящей в пакет программ MEGA 3.1 [34]. Полученные результаты анализировали с помощью пакета программ MEGA 3.1, для расчета расстояний использовали модели Kimura 2 и p-distance [35]. Построенные филогенетические древа тестировали с помощью бутстреп-метода [36].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
С-дифференциалъное окрашивание
Z. biebersteiniana. При С-окрашивании хромосом Z. biebersteiniana выявляются крупные при-центромерные и мелкие интеркалярные и прите-ломерные блоки гетерохроматина. В целом полученный нами рисунок С-окрашивания хромосом Z. biebersteiniana сходен с описанным ранее [8, 12]. Незначительные различия рисунков окрашивания, полученных разными авторами при исследовании видовых образцов разного происхождения,
•I .■? л А Я
^ ^ ß 4 i II 's. к ^ ■ « 1' 1 ß f* £». \i a i Г- 0 ft » 1 « 1J
1 2 а «# 2 а 1 2 3 4
?ч 2 ° 1 1 „ - J dVb
2 2 е 1 1 _ / жж > ~ V з
Рис. 1. Zingeria biebersteiniana. а, б - С-окрашенные кариотипы; в, е - окрашенные DAPI метафазы; г, ж - FISH c пробами 45S рДНК; д, з - FISH c пробами 5S рДНК хромосом растений из популяций лимана Пришиб и с. Рахинки соответственно. Цифрами обозначена нумерация хромосом. Длинными стрелками указаны основные локусы риб
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.