АГРОХИМИЯ, 2014, № 3, с. 75-82
УДК 631.465:631.472.74:633.34:632.112
УРЕАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ В РИЗОСФЕРЕ РАСТЕНИЙ СОИ
В УСЛОВИЯХ ЗАСУХИ
© 2014 г. Е.Е. Емнова, С.И. Тома, Я.В. Бызган, О.В. Дарабан
Институт генетики и физиологии растений АНМ Кишинев, ул. Пэдурий, 20, МД-2002, Республика Молдова E-mail: kateemnova@mail.ru
Поступила в редакцию 00.00.2013 г.
В полевом мелкоделяночном опыте на черноземе карбонатном с внесением перед посевом удобрений N20P60 выращивали без орошения 2 сорта сои (Glycine max L.). Измеряли уреазную активность в почве ризосферы (0-20 см) и в тонких нелигнифицированных корнях растений сои в фазах цветения (при влажности почвы 19% ПВ) и формирования бобов (33% ПВ). Уреазная активность в почве снижалась при внесении N и N33 по сравнению с выращиванием сои без удобрений. Наиболее сильным фактором, влияющим на активность ризосферной и корневой уреазы, являлся уровень почвенной влажности. При резком дефиците влаги в фазе цветения сои уреазная активность почвы была в 2-3 раза меньше, чем после выпадения осадков в фазе формирования бобов. Напротив, активность корневой уреазы при влажности почвы 19%ПВ была достоверно больше в 3-5 раз по сравнению с ее уровнем в корнях при 33% ПВ. Сорт сои и вид азотных удобрений влияли достоверно на уреазную активность, но в меньшей степени.
Ключевые слова: уреазная активность, соя (Glycine max L.), ризосфера, засуха.
ВВЕДЕНИЕ
Биологические свойства почвы непосредственно зависят от содержания почвенной влаги [1]. Глобальные изменения климата планеты, приводящие к более частому возникновению почвенной засухи, крайне негативно влияют на жизнедеятельность почвенных организмов и, как следствие, на биохимические процессы, связанные с плодородием почв [2]. Адаптационные механизмы почвенных микроорганизмов и культивируемых растений связаны с изменениями их метаболизма. Степень приспособленности определяется скоростью и глубиной этих изменений, направленных на сохранение координации их биологических функций и связи со средой обитания. Активное взаимодействие ризосферной микрофлоры с корнями растений определяет интенсивность биохимических процессов минерализации органического вещества почвы и мобилизации необходимых питательных элементов. Растения сои обладают хорошо развитой корневой системой, благодаря чему эту культуру иногда рассматривают как относительно устойчивую к временному дефициту увлажнения [3]. Однако недостаток почвенной влаги может ослаблять симбиотические взаимоотношения с клубеньковыми бактериями и радикально изменять метаболизм азота как в ризо-
сфере, так и в корнях растений сои. Показано, что прием повышения урожая зернобобовых путем инокуляции семян препаратами клубеньковых бактерий эффективен в годы с достаточным количеством осадков, тогда как в засушливые годы он не работает [4].
Известно, что мочевина в растениях играет роль, аналогичную аспарагину и глютамину [5]. Она служит веществом, в виде которого обезвреживается аммиак, поступающий из почвы при разложении белков и аминокислот. Также она является источником азота для синтеза новых белков в растениях при наличии достаточного количества углеводов. Синтез мочевины в растительном организме возможен либо из аммиака, образующегося при диссимиляции белков и аминокислот, либо при избыточном питании аммонийными солями в условиях хорошей аэрации. Образование мочевины происходит в орнитиновом цикле Кребса-Ханзелейта [5]. Другим источником мочевины в растении могут быть продукты разложения нуклеопротеидов, а именно аллантоин и аллан-тоиновая кислота, которые найдены в растениях сои в значительных количествах. Более того, у сои при симбиотической фиксации атмосферного азота основными азотистыми соединениями, транспортируемыми из клубеньков в надземную часть растений сои, также являются аллантоин и
аллантоиновая кислота (уреиды) [6]. В процессе метаболизма возможна их трансформация в мочевину с участием фермента аллантоиказы. Известно, что корни растений обладают способностью к поглощению растворимых низкомолекулярных органических соединений азота, например, мочевины, аминокислот, полиаминов, небольших полипептидов [7]. При дефиците влажности почвы у растений сои возникает необходимость наряду или вместо симбиотической азотфиксации запускать альтернативные процессы по обеспечению источниками азота для метаболических перестроек, необходимых в экстремальных условиях.
Таким образом, мочевина занимает важное место в метаболизме растений сои. Использование мочевины для целей синтеза может осуществляться в растениях благодаря наличию в них активной уреазы.
Цель работы - исследовать активность уреазы в почве ризосферы и корнях сои для выяснения ее роли в обеспечении азотом растений при возникновении почвенной засухи, а также проверить влияние формы азота в удобрении на уреазную активность.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование выполняли в 2012 г. на научно-экспериментальной базе Института генетики и физиологии растений АН Молдовы (Кишинев, центральная зона Республики Молдова). В полевых условиях без орошения возделывали 2 сорта сои (Glycine max L.) на черноземе карбонатном с содержанием органического вещества 2.66 ± 0.04% ( ± о, стандартное отклонение при n = 8) и рНН2О 7.61 ± 0.03 ( ± о, n = 8). Весь вегетационный период растений сои сопровождали условия засухи. Изучение влияния засухи на продуктивность сои в период 2000-2009 гг. в северной зоне Республики Молдова показало, что практически все сорта сои местной селекции, возделываемые в настоящее время, уязвимы в условиях гидротермического стресса, при этом потери урожая составляли до 40-50% [8]. В данном опыте использовали 2 сорта сои Аура (А) и Индра (И), различавшиеся по продуктивности (И > A) и толерантности к снижению почвенной влажности (И < A) [8].
Фосфорные удобрения в виде Рс вносили в почву перед посевом из расчета Р60 во всех удобренных вариантах [4, 9]. Схема опыта включала 4 варианта: 1 - контроль (почва без удобрений), 2 - NH10, 3 -NH20, 4 - N3320. Расположение делянок систематическое, их площадь - 5 х 2.5 м с расстоянием между рядами 0.5 м, между делянками - 1 м. Общая
площадь участка с краевым защитным поясом из сои составила 625 м2.
Отбор образцов почвы ризосферы и корней (боковые тонкие нелигнифицированные) проводили в период максимального потребления растениями влаги и азота: в фазах цветения, когда влажность почвы составляла 19% ПВ, и формирования бобов (33% ПВ).
Образцы почвы для анализа собирали путем стряхивания слоя, прилегающего непосредственно к корням, просеивали через сито с диаметром отверстий 2 мм, удаляя растительные остатки, и хранили в холодильнике (4°С) до анализа [10].
Уреазную активность почвы (Уре) (запас экзогенных ферментов, иммобилизованных на почвенном матриксе) (Уре, КФ 3.5.1.16) измеряли на основе метода [11]. Пробы почвы (2.5 г) инкубировали в течение 24 ч при температуре 37°С в герметично закрытых конических колбах (50 мл) с 10 мл 5%-ного водного раствора мочевины и в присутствии 4 капель толуола (для исключения активности почвенных микроорганизмов во время инкубации). Продукт реакции (ионы аммония NH4+) экстрагировали 7.5 мл 1 н. KCl. Конечный объем фильтрата равен 17.5 мл. Встряхивали колбу 5 мин и фильтровали содержимое через складчатый фильтр. К 0.1 мл фильтрата добавляли 9.1 мл дистиллированной воды, 0.4 мл 50%-ного раствора сегнетовой соли для предотвращения выпадения органо-минеральных хлопьев и 0.4 мл реактива Несслера для получения окрашенного (желто-оранжевого) продукта. Конечный объем реакционной смеси составил 10 мл. Интенсивность окраски измеряли на спектрофотометре ТС80 (Великобритания) при длине волны 450 нм и величине светового пути 10 мм. Калибровочную кривую строили по серии растворов NH4Cl. Уреазную активность выражали в мкг NH^/г сухой почвы/ч при 37°С [2].
Сразу после отбора проб корни отмывали водопроводной водой от почвы, ополаскивали охлажденной дистиллированной водой и оставляли в холодильнике (4°С, не более 24 ч). На следующие сутки после отбора у каждого образца ножницами отделяли тонкие нелигнифицированные корневые нити и помещали образцы в морозильную камеру холодильника (-18°C). В день определения растительный материал (0.5 г) растирали пестиком в фарфоровой ступке на льду с измельченным стеклом и охлажденным цитратно-фосфатным буфером Мак-Илвейна (0.1 М лимонная кислота : 0.2 M Na2HPO4, рН 7.0, 4°С) [12]. Стекло предварительно обрабатывали раствором бихромата калия в серной кислоте, промывали дистиллиро-
□ N-NH4 □ N-NO3
2.4
2.0
>4 §
БL6 «
о X
О 1.2
[ч
о
0
1 0.8
0.4-
0.0
*б
*б
о
S
Î *
О
<4.
Сорт Аура, ФЦ, 19% ПВ
о
з
*
Й IÎ
Сорт Индра, ФЦ
* *б й
*ай а iï &
о
г
о
<4
Сорт Аура, ФОБ, 33% ПВ
о
г
о
Сорт Индра, ФОБ
Исх. П, 44% ПВ
Варианты
Рис. 1. Содержание подвижных форм азота в черноземе карбонатном под соей в фазе цветения и формирования бобов. ФЦ - фаза цветения, ФОБ - фаза образования бобов. Исх. П 44% ПВ - исходная почва при влажности 44% ПВ. То же на рис. 2-4. Обозначения статистической значимости различий средних величин изученных показателей между вариантами: * - с удобрением versus контроль без удобрений; а и б - N20 versus Naa20 отдельно для каждого сорта сои и каждого измеренного показателя (по критерию Фишера). То же на рис. 3.
ванной водой, сушили и измельчали. Полученную пасту растертых корней количественно переносили с помощью указанного выше цитратно-фосфатного буферного раствора (всего 30 мл) в колбы и хранили полученную суспензию-экстрат в холодильнике не более 24 ч до определения активности фермента.
Определение активности уреазы в тонких нелиг-нифицированных корнях проводили с учетом рекомендаций, приведенных в работах [12, 13]. Алик-воты по 10 мл суспензии-экстракта инкубировали 24 ч при температуре 37°С в колбах под пробкой с 10 мл 10%-ного раствора мочевины и добавлением толуола. Реакцию останавливали 5 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и экстрагировали ионы аммония NH4+ с помощью 10 мл 1 н. KCl. Конечный объем составлял 35 мл. После активного встряхивания содержимое колб фильтровали через складчатый фи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.