научная статья по теме УРОВЕНЬ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ МОЛЕКУЛЫ БЕТА-АМИЛОИДА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ СВЕРХВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ Биология

Текст научной статьи на тему «УРОВЕНЬ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ МОЛЕКУЛЫ БЕТА-АМИЛОИДА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ СВЕРХВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 4, с. 696-704

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ

УДК 577.112.083

УРОВЕНЬ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ МОЛЕКУЛЫ БЕТА-АМИЛОИДА, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ СВЕРХВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ

© 2014 г. И. А. Попов1, 2, 3,4,5, М. И. Индейкина1, 2, 3, С. И. Пеков1, 3, Н. Л. Стародубцева1,3,4, А. C. Кононихин1, 3, 4, М. И. Николаева1, Е. Н. Кукаев1, 3, 4, Ю. И. Костюкевич1, 4, С. А. Козин2, 5, А. А. Макаров2, Е. Н. Николаев1, 3, 4, 5*

Институт энергетических проблем химической физики им. В.Л. Тальрозе Российской академии наук, Москва, 119334 2Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 3Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, Москва, 119334 4Московский физико-технический институт (Государственный университет), Долгопрудный, Московская область, 141700 5Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук, Москва, 119334 Поступила в редакцию 07.03.2014 г.

Принята к печати 13.03.2014 г.

Недавно показано, что фосфорилированный по серину в положении 8 бета-амилоид (Ap) тесно связан с патогенезом болезни Альцгеймера. Вследствие того, что эта химическая модификация затрагивает ключевой фрагмент металлсвязывающего домена Ap и может серьезно влиять на взаимодействие pS8-Ap с ионами цинка, ее считают потенциальным предшественником патогенных олигомеров Ap. Соответственно содержание pS8-Ap в биологических жидкостях человека (кровь, моча, спинномозговая жидкость) может отражать различные стадии патогенеза болезни Альцгеймера. Цель исследования - разработка прототипа аналитического метода количественного определения изоформы pS8-Ap в бинарных смесях с интактным Ap и уровня фосфорилирования амилоида, содержащегося в крови больных с диагнозом болезнь Альцгеймера.

Ключевые слова: фосфорилирование, бета-амилоид, масс-спектрометрия, количественная оценка.

ESTIMATION OF PHOSPHORILATION LEVEL OF AMYLOID BETA, EXTRACTED FROM HUMAN BLOOD PLASMA. ULTRA HIGH RESOLUTION MASS SPECTROMETRY by I. А. Popov1,2 3 4 5, М. I. Indeykina1,2 3, S. I. Pskov13, N. L. Starodubtseva1,3,4, А. S. Kononikhin1,3 4, М. I. Nikolaeva\ Е. N. Kukaev1,3 4, S. А. Kozin2 5, А. А. Makarov2, Е. N. Nikolaev1,3 4 5* (1Talrose Institute for Energy Problems of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119334 Russia; 2Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; 3Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119334 Russia; 4Moscow Institute of Physics and Technology (State University), Dolgoprudniy, Moscow region, 141700 Russia; 5 Orekhovich Institute of Biomedical Chemistry, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 119334 Russia; *e-mail: ni-kolaev@chph.ras.ru). Recently it has been shown that phosphorylation of the Ser8 residue in amyloid-beta (pS8-Ap) is tightly involved in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Since this modification occurs in the key metal-binding domain of amyloid-beta, and thus should seriously affect the interaction of pS8-Ap with zinc ions, this isoform might be a potential precursor of pathogenic oligomeric forms of amyloid beta. Hence the level of pS8-Ap in human biological fluids (such as blood, urine, cerebral spinal fluid) might resemble the different stages of the pathogenesis ofAlzhe-imer's disease. The aim of this work was to develop a prototype of an analytical method for quantitative determination of the level of pS8-Ap isoform in binary mixtures with native amyloid-beta in order to further use it to determine the levels of phosphorylated amyloid-beta in blood plasma samples of patients with Alzheimer's disease.

Keywords: phosphorylation, amyloid-beta, mass-spectrometry, quantitation. DOI: 10.7868/S0026898414040090

Принятые сокращения: БА - болезнь Альцгеймера; pS8-AP - фосфорилированный по серину в положении 8 бета-амилоид.

* Эл. почта: nikolaev@chph.ras.ru

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Альцгеймера (БА) — самая распространенная нейродегенеративная протеинопатия в мире [1] — затрагивает около 30 млн. пациентов [2]. В России таких больных насчитывается более полумиллиона человек [3]. На нейроморфологи-ческом уровне БА связана с наличием в специфических отделах коры головного мозга внеклеточных полимерных агрегатов, так называемых амилоидных бляшек, окруженных поврежденными нейронами [4]. Основным компонентом амилоидных бляшек является бета-амилоидный белок (бета-амилоид, АР), состоящий из 39-43 аминокислотных остатков [5]. Согласно широко принятой "милоидной гипотезе", накопление Ар в виде амилоидных бляшек представляет собой главную причину возникновения БА, в то время как остальные проявления этой болезни вызваны хроническим дисбалансом между продукцией и катаболизмом Ар в организме [6].

Предполагают, что олигомеризация Ар инициирует патогенетические процессы, приводящие к БА [7—12]. Установлено, что димеры Ар нейро-токсичны, а их концентрация в крови пациентов с диагнозом БА коррелирует с клиническими проявлениями этого заболевания [13, 14].

Движущие силы патологической агрегации Ар неизвестны, однако установлено, что ионы цинка играют в этом процессе критическую роль [15]. Ар человека связывает ион цинка посредством своего металлсвязывающего домена 1-16 [16—20], в этом же домене находится участок 11-14, отвечающий за цинкиндуцированную димеризацию Ар [21], которая приводит к образованию устойчивых агрегатов Ар с параллельной бета-укладкой мономеров [22].

Современные аналитические методы не позволяют достоверно и воспроизводимо оценить концентрацию растворимых патогенных олиго-меров Ар в биологических жидкостях пациентов вследствие большой вариабельности в размерах и свойствах таких олигомеров. В то же время существуют экспериментальные свидетельства того, что конформационно измененные (под воздействием внешних молекулярных агентов, включая белки-партнеры и низкомолекулярные соединения, или вследствие мутаций и/или химических модификаций) изоформы Ар могут играть роль центров зарождения олигомеров Ар и, таким образом, выступать в роли биомаркеров патологического процесса [23—25].

Обратимое фосфорилирование боковых цепей аминокислот (+80 Да) — одна из наиболее часто встречающихся посттрансляционных модификаций. Она представляет самый распространенный способ регуляции активности ключевых белков клетки, в том числе ферментов и белков сигнальных путей. Под реакцией фосфорилирования бел-

ка понимают присоединение фосфатной группы через фосфоэфирную связь (О-фосфорилирова-ние) к гидроксильной группе боковой цепи остатка серина, треонина или тирозина, донором фосфата при этом является АТР. В природе встречается также фосфорилирование по остаткам гистидина и аргинина (N-фосфорилирование), аспартата и глута-мата (A-фосфорилирование) [26]. Образующиеся при фосфорилировании эфиры фосфорной кислоты весьма стабильны. Введение в молекулу белка остатка фосфорной кислоты, как правило, меняет ее свойства, а именно: пространственную структуру молекулы и, как результат, его активность и способность связываться с другими молекулами.

Недавно показано, что фосфорилированный по серину в положении 8 Ap (pS8-AP) тесно связан с патогенезом БА [25, 27—29]. Вследствие того, что данная химическая модификация затрагивает ключевой фрагмент металлсвязывающего домена Ар и должна серьезно влиять на взаимодействие pS8-Ap с ионами цинка, эту изоформу Ар считают потенциальным предшественником патогенных олигомеров Ap. Соответственно содержание pS8-Ap в биологических жидкостях человека (кровь, моча, цереброспинальная жидкость) может отражать различные стадии патогенеза БА.

Цель настоящей работы - разработка прототипа аналитического метода для количественного определения изоформы pS8-Ap в бинарных смесях с интактным Ap.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Метод определения уровня фосфорилирования Ap

разработали для исследования уровня фосфорили-рования амилоида, содержащегося в крови больных с диагнозом БА. При использовании протоколов выделения на основе твердофазной экстракции, как, например, описано в работе [30], из 10 мл крови можно получить водный раствор, содержащий до нескольких сотых мкг пептида. Полученные образцы для дальнейшего масс-спектрометрического анализа с использованием электроспрейной ионизации растворяли в подкисленной водно-ацетонит-рильной смеси (50% ACN + 0.1% FA).

Измерения масс-спектров каждого из образцов проводили на масс-спектрометре LTQ FT Ultra с электроспрейным источником ионов IonMax. Раствор исследуемых веществ вводили при помощи шприцевого насоса со скоростью 1 мкл/мин через полую металлическую иглу, на которой поддерживали постоянное напряжение на уровне 3.2—3.7 кВ. Расстояние между иглой и нагреваемым капилляром, являющимся входным интерфейсом вакуумной системы масс-спектрометра, выдерживали на уровне 4—5 мм. Распылительные газы не использовали.

100 80 60 40

Ц 20

и

§ 0

д

u 100 £

О80

60 40 20

519.98

Ab-PO

3

mh3+

692.97

300

616.52 1 _ 1

790.39 I 823.38 758.24 892.45

980.30

499.99

400

500

600 700 m/z

800

900

1000

Рис. 1. Масс-спектры сверхвысокого разрешения фосфорилированного по серину-8 Aß 1-16 (а) и немодифицирован-ного Aß 1-16 (б).

a

0

Исследование процессов ионизации фосфорили-рованого и нормального амилоида на модельных смесях пептидов. На рис. 1 представлены масс-спектры продуктов электроспрейной ионизации фосфорилированного и немодифицированного пептидов, разница в массах которых составляет 80Да, что соответствует разнице масс, вносимой фосфогруппой. На обоих спектрах хорошо различимы пики, соответствующие зарядовым состояниям 3+ и 4+ с m/z = 692.97 Th и 519.98 Th для фосфорилированного пептида и с m/z = 666.32 Th и 499.99 Th для немодифицированного пептида.

Таким образом, ионизация обоих пептидов проходит схожим образом, а интенсивности пиков, соответствующих определенным зарядовым состояниям, у модифицированного и немодифициро-ванного пептидов существенно не различаются.

Замечено, что при

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком