== ГЕНЕТИКА =
УДК 575.2.084+581.1
УРОВЕНЬ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КЛЕТОК В ДЛИТЕЛЬНО КУЛЬТИВИРУЕМОЙ СУСПЕНЗИИ Arabidopsis thaliana
© 2014 г. К. А. Седов, А. А. Фоменков, А. И. Соловьева, А. В. Носов, Ю. И. Долгих
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 127276Москва, ул. Ботаническая, 35 E-mail: gsc@ippras.ru Поступила в редакцию 15.01.2014 г.
Определены уровни гетерогенности и генетической изменчивости клеток в суспензии Arabidopsis thaliana, культивируемой in vitro более 7 лет. Показана значительная гетерогенность суспензии по размеру клеток. С помощью цитофотометрического анализа количества ядерной ДНК выявлена миксоплоидность суспензионной культуры. С использованием ДНК-маркеров (шести RAPD- и четырех ISSR-праймеров и их внутригрупповых комбинаций) показана низкая степень вариабельности ДНК. Генетические отличия полученных из суспензионной культуры клонов от растения ин-бредной линии Col-0 составили 1.5%. Различия между клонами были выявлены только с одной парой праймеров (M3+M7). Отмечено, что вариации количества ДНК в клетках суспензионной культуры не сопровождаются существенными изменениями последовательности ДНК.
DOI: 10.7868/S0002332914060101
Arabidopsis thaliana — модельное растение, широко используемое для проведения генетических и молекулярно-биологических исследований. Во многих работах, особенно при получении трансгенных растений, применяется культура изолированных тканей A. thaliana. Известно, что культивирование in vitro индуцирует генетическую изменчивость, и растения, регенерированные из культивируемых клеток, нередко отличаются от исходных форм. Показано, что среди растений-регенерантов A. thaliana встречаются формы с изменениями морфологических признаков или сроков цветения (Jiang et al, 2011), летальными и "хлорофильными" мутациями (Gaj, Maluszynska, 1987). Было показано, что введение в культуру тканей пыльников сопровождалось появлением полиплоидных и анеуплоидных каллусных клеток, среди регенерированных растений также встречались формы с измененным числом хромосом (Keathley, Scholl, 1983). Частота хромосомных вариаций в разных работах существенно изменяется. Например, в исследовании, проведенном Сангван с соавт., 95% полученных регенерантов A. thaliana были диплоидными и не имели морфологических аномалий (Sangwan et al., 1992). В то же время Фрас и Малусзинска (Fras, Maluszynska, 2003) обнаружили высокую скорость полиплои-дизации клеток после введения в культуру. Изменение числа хромосом проявилось и у части полученных из каллуса растений: ~25% регенерантов были три- и тетраплоидными, хотя исходные растения были диплоидными.
Определение уровня генетической изменчивости растений с помощью молекулярных методов дает возможность выявить изменения последовательности ДНК независимо от их фенотипиче-ского проявления. В ряде случаев такая оценка более информативна, чем результаты кариологи-ческих или фенотипических анализов. С помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с разными видами праймеров проанализирована изменчивость культивируемых тканей многих видов растений (Гостимский и др., 2005). Простой и информативный метод — анализ с помощью ПЦР с использованием RAPD-прайме-ров. К его достоинствам можно отнести небольшое количество ДНК для анализа, а также отсутствие необходимости сбора сведений о последовательности генома изучаемых клеток для создания праймеров. Не менее информативен ISSR-метод, основанный на амплификации участков ДНК, примыкающих к микросателлит-ным последовательностям, благодаря тому что микросателлиты широко распространены по всему геному. RAPD- и ISSR-маркеры были с успехом использованы для оценки генетического полиморфизма у многих видов растений (Soneli et al, 2002; Bairu et al, 2011).
Данные об изменчивости ДНК-маркеров в культурах клеток A. thaliana практически отсутствуют. Результаты анализа растений, регенерированных из культивируемых тканей, немногочисленны и довольно противоречивы (Polanco, Ruiz, 2002; Labra et al., 2004; Jiang et al, 2011). Во всех случаях анализировали растения, получен-
Праймеры, использованные для RAPD- и ISSR-ана-лиза
Праймер Последовательность нуклеотидов (5'-3') Температура отжига, °C
RAPD-праймеры
474 AGG-CGG-GAA-C 36
481 ACA-GGT-GCG-T 36
S97 ACG-ACC-GAC-A 34
S2055 CCA-GAC-TCC-A 32
S2056 CTG-GTG-CTC-A 32
QR-2 CGG-CCA-CTG-T 36
ISSR-праймеры
M3 (AG)8TA 52
M4 (AC)9T 56
M7 (GA)8CAG 56
A4 (ATG)5 56
ные из каллуса после кратковременного культивирования. Влияние на геном A. thaliana длительного пребывания в условиях in vitro до сих пор не исследовано.
Цель работы — определение уровня генетической изменчивости в культуре изолированных клеток A. thaliana, длительно поддерживаемых в условиях in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования была суспензионная культура A. thaliana (L.) Heynh. (экотип Columbia, инбредная линия Col-0), полученная из каллу-сной ткани, сформированной на эксплантах полностью развернувшихся розеточных листьев. Суспензионная культура клеток поддерживается in vitro более 7 лет на среде Шенка-Хильдебранд-та (Shenk, Hildebrandt, 1972) с 1 мг/л 2,4-Д и 0.1 мг/л кинетина при 26°С в темноте на горизонтальном шейкере (110 об./мин). Суспензию суб-культивировали каждые 10 сут, перенося 4-милли-литровый инокулят клеток в 50 мл свежей среды. Индекс роста по числу клеток составлял 15-18.
Размеры клеток суспензионной культуры определяли по диаметру протопластов, которые выделяли методом, описанным ранее (Носов и др., 2012). Анализировали 3000 протопластов.
Цитофотометрический анализ количества ядерной ДНК проводили на давленных постоянных препаратах, после окрашивания их методом Фельгена, с некоторыми изменениями классической методики. Препараты анализировали на микроскопе с цитофотометром Univar (Reichert-
Jung, Австрия) двухволновым методом (Zoriniants et al., 2003). Было проанализировано >3000 протопластов и >300 ядер.
Для расчета плоидности ядер клеток суспензионной культуры по количеству ДНК использовали стандарт — профазные (4C) ядра клеток апикальной меристемы корня Vigna radiata cv. Berkin, содержащие ~2.1 пг ДНК, а также данные о количестве ДНК в диплоидных ядрах клетокA. thaliana (2С = 0.32—0.4 пг), представленные в базе данных Kew Botanical garden (www.kew.org.uk/cvalues). За 1С принимали количество ДНК в нереплициро-ванном гаплоидном наборе хромосом.
Для анализа генетической гетерогенности клеток из суспензии были выделены отдельные клоны. Для их получения использовали метод высева клеток на агаризованную питательную среду. Клетки распределяли по поверхности среды тонким слоем с помощью шпателя. Чашки Петри инкубировали при 26°C. Через 4 нед пересаживали на свежую питательную среду колонии диаметром >3 мм. Дальнейший учет и пересадку каждой колонии проводили отдельно.
ДНК выделяли по методике CTAB, описанной ранее (Moller et al., 1992), из 100 мг каллусной ткани и листьев. Концентрацию ДНК оценивали с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США). Целостность ДНК оценивали с помощью электрофореза в 1%-ном ага-розном геле.
Синтез олигонуклеотидных RAPD- и ISSR-прай-меров осуществляли в НПФ "Литех" (Россия). Были использованы шесть RAPD- и четыре ISSR-прайме-ров, а также их внутригрупповые комбинации. Ориентировочную температуру отжига для каждого праймера определяли по формуле
t = 4(G + C) + 2(A + T),
где t,°C — температура отжига; G, С, A, T — соответственно числа оснований гуанина, цитозина, аденина и тимина в последовательности прайме-ра. Для комбинации праймеров рассчитывали среднее значение температуры.
Сочетание RAPD- и ISSR-праймеров в одной реакции не применяли, так как данные виды праймеров сильно отличаются по температуре отжига. Праймеры, с помощью которых проводили анализ генетической изменчивости, представлены в таблице.
Реакционная смесь для амплификации ДНК объемом 25 мкл содержала 70 мМ Tris-HCl (pH 8.6), 16.6 мМ (NH4)2SO4, 2.5 мМ MgCl2, 0.0125% Cresol Red, 6.25% глицерина, 0.2 мМ каждого dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), 0.25 мМ праймера, 2 ед. Taq-полимеразы (НПАО "Силекс М", Россия), 40 нг ДНК. Для предотвращения изменения концентрации компонентов из-за образования
УРОВЕНЬ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ КЛЕТОК
567
конденсата на реакционную смесь наслаивали 20 мкл минерального масла.
Амплификацию проводили в программируемом термоциклере MC2 (ЗАО "ДНК-технология", Россия) по следующей программе: денатурация 94°C/2 мин; 5 циклов: денатурация 94°C/20 с, отжиг t/10 с, элонгация 72°с/10 с; 35 циклов: денатурация 94°C/5 с, отжиг t/5 с, элонгация 72°C/5 сек; 1 цикл: элонгация 2 мин (t — температура отжига для RAPD- (32—36°C) и ISSR-праймеров (52—56°C)). Для уменьшения образования неспецифических продуктов амплификации применяли технологию "горячего старта" (Bassam, Caetano-Anolles, 1993).
Продукты реакции (15 мкл из реакционной смеси) разделяли электрофорезом в 2%-ном ага-розном геле в трис-боратном буфере с последующим окрашиванием бромистым этидием. Для определения длины фрагментов использовали маркер M26 (100 bp DNA Ladder, НПО СибЭн-зим, Россия). Анализ повторяли дважды, а с праймерами, показавшими полиморфизм ампли-фицированных фрагментов ДНК, — 5 раз.
Для определения уровня генетической изменчивости сравнивали спектры ампликонов исходных растений и полученных из суспензии клонов. Генетическое расстояние (Gd) рассчитывали по формуле (Nei, Li, 1979)
Gd = 1 - 2Nxy/(N + Ny),
где Nx — число зон, имеющихся в спектре исходных растений, но отсутствующих в спектре клеток суспензии; Ny — число зон в спектре клеток суспензии, но не в спектре исходных растений; N^ — число зон, общих для обоих спектров.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Измерение диаметров протопластов, выделенных из суспензионной культуры клеток в логарифмической фазе субкультивирования, позволило оценить неоднородность популяции клеток по размерам. Как видно на рис. 1а, диаметры протопластов варьируют более чем в 3 раза, при этом >80% из них составляют от 17 до 29 мкм.
Распределение клеток суспензии по количеству ядерной ДНК, представленное на рис. 1б, демонстрирует, что культура
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.