МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 4, с. 654-667
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА
УДК 575:599.9
Ускоренная публикация
УРОВЕНЬ МЕТИЛИРОВАНИЯ ПРОМОТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА RASSF1A В ПЕРВИЧНЫХ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЯХ
© 2004 г. В. И. Логинов1*, А. В. Малшкова1, Ю. А. Серегин1, Д. С. Ходырев1, Т. П. Казубская2, В. Д. Ермилова2, Р. Ф. Гарькавцева2, Л. Л. Киселев3, Е. Р. Забаровский3, 4, Э. А. Брага1*
Государственный научный центр Российской Федерации "ГосНИИгенетика", Москва, 117545 2Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук,
Москва, 115478
3Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991 4Microbiology and Tumor Biology Center and Center for Genomics and Bioinformatics, Karolinska Institute,
Stockholm, 17177 Sweden Поступила в редакцию 24.02.2004 г.
Ген RASSF1A (3p21.31) относится к группе генов-супрессоров опухолевого роста. Изучен уровень метилирования CpG-островка в промоторном районе этого гена в первичных опухолях почек, молочной железы и яичников в московской популяции (172 случая). Использован метод ПЦР, специфичной к метилированному аллелю (МСП), а также анализ с помощью метилчувствительных рес-трикционных эндонуклеаз и последующей ПЦР (МЧРА). Результаты этих методов с высокой достоверностью (согласно ранговой корреляции Спирмана, P < 10-6) согласуются между собой и с ранее полученными данными бисульфитного секвенирования. По данным МСП и МЧРА частота метилирования промоторного района гена RASSF1A составила 86% (25/29) и 94% (50/53) при почеч-ноклеточном раке, 64% (18/28) и 78% (32/41) при раке молочной железы и 59% (17/29) и 73% (33/45) в эпителиальных опухолях яичников соответственно. Применение набора метилчувствительных рестриктаз (HpaII, HhaI, Bsh1236I, AciI) повысило чувствительность анализа и позволило изучить статус метилирования 18 CpG-пар промоторного района гена RASSF1A. На основании этих данных удалось оценить плотность метилирования CpG-островка, которая достигала 72% в опухолях почки, 63% при раке молочной железы и 58% при раке яичников (за 100% принято произведение исследованных 18 CpG-пар на число образцов, в которых выявлено метилирование). Метилирование промоторного района гена RASSF1A (11-35%) наблюдали и в образцах ДНК из гистологически нормальной ткани, прилежащей к опухоли, но оно полностью отсутствовало в этих же участках ДНК из крови здоровых доноров (0/15). Частота метилирования CpG-островка в опухолях не зависела от стадии, степени анаплазии и наличия метастазов. С другой стороны, эпигенетическую модификацию гена RASSF1A в опухолях наблюдали существенно чаще, чем геми- и гомозиготные делеции в области этого гена. Согласно этим наблюдениям, метилирование промоторного района гена RASSF1A относится к ранним событиям в онкогенезе и представляет один из главных путей инактивации этого гена в эпителиальных опухолях.
Ключевые слова: ген-супрессор опухолевого роста, метилирование ДНК, CpG-островки, промотор-ные районы, ген RASSF1A, эпителиальные опухоли.
METHYLATION OF THE PROMOTER REGION OF THE RASSF1A GENE, A CANDIDATE TUMOR SUPPRESSOR, IN PRIMARY EPITHELIAL TUMORS, by V. I. Loginov1*, A. V. Malyukova1, Yu. A. Seryogin1,
D. S. Hodyrev1, T. P. Kazubskaya2, V. D. Ermilova2, R. F. Garkavtseva2, L. L. Kisselev3, E. R. Zabarovsky3,4,
E. A. Braga1* (1Russian State Genetics Center GosNIIgenetika, Moscow, 117545 Russia; *e-mail: loginov7@genetika.ru; 2Blokhin Cancer Research Center of the Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 115478 Russia; 3Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; 4Microbiology and Tumor Biology Center, Center for Genomics and Bioinformatics, Karolinska Institute, Stockholm, 17177 Sweden). Methylation of the promoter CpG-islands of the candidate tumor suppres-
Принятые сокращения: BC - рак молочной железы (breast carcinoma); HD - гомозиготная делеция (homozygous deletion); LUCA - район кандидатов в супрессорные гены рака легкого (lung cancer); LOH - потеря гетерозиготности (loss of heterozygosity); ПЦР - полимеразная цепная реакция; МСП - ПЦР, специфичная к метилированному аллелю; МЧРА - анализ с применением метилчувствительных рестрикционных эндонуклеаз и последующей ПЦР; OET - эпителиальные опухоли яичников (ovarian epithelial tumors); RCC - почечноклеточный рак (renal cell carcinoma); TSG - ген-супрессор опухолевого роста (tumor suppressor gene); QPCR - ПЦР в режиме реального времени (real time PCR).
*Эл. почта: loginov7@genetika.ru, ebraga@genetika.ru; ebraga@proc.ru
sor gene RASSFIA (3p21.31) was studied in primary tumors of kidney, breast and ovary (172 cases). Methyla-tion-specific PCR (MSP) and methyl-sensitive restriction endonuclease digestion followed by PCR (MSRA) were applied. Statistically significant correlation (P < 10-6) was shown for the results of the MSP and MSRA, and the data of bisulfite sequencing reported earlier. The frequency of RASSFIA methylation according to MSP and MSRA was 86% (25/29) and 94% (50/53) in renal cell carcinoma (RCC) and 64% (18/28) and 78% (32/41) -in breast carcinoma (BC) samples, and 59% (17/29) and 73% (33/45) in ovarian epithelial tumors (OET), respectively. The use of several methyl-sensitive restriction enzymes (Hpall, Hhal, BshI236I, Acil) enhanced the sensitivity of MSRA and allowed to analyze methylation status of 18 CpG-pairs in the RASSFIA CpG-island. Density of methylation of the RASSFIA CpG-island was 72% (644/900) in RCC, 63% (361/576) in BC, and 58% (346/594) in OET samples (18 CpG-pairs multiplied to the number of samples shown methylation were assumed as 100%). The RASSFIA gene methylation was also observed in samples of morphologically normal tissues adjacent to corresponding tumors (11-35%), but it was not detected in blood DNAs of healthy donors (0/15). The RASSFIA methylation frequency did not show significant correlation to tumor stage, grade and metastases (P = 0.3-1.0). The RASSFIA gene methylation was observed more frequently than other investigated aberrations - hemi- and homozygous deletions inside or around this gene. These observations are consistent with the hypothesis that the RASSFIA gene methylation is an early event in the carcinogenesis and one of the dominant ways of its inactivation.
В регуляции экспрессии генов, связанных с развитием злокачественных опухолей, все большая роль отводится метилированию CpG-островков в промоторных районах [1, 2]. Эпигенетическая модификация регуляторных участков нарушает их взаимодействие с факторами транскрипции, блокируя эти участки с помощью белков, специфично связывающихся с метилированными CpG-па-рами (Methyl-CpG binding proteins), и, кроме того, вносит изменения в окружающий хроматин, переводя его в стабильно репрессированное состояние [3, 4]. Эпигенетическое метилирование промоторных районов вызывает инактивацию транскрипции многих генов-супрессоров опухолевого роста (TSG). Так, выявлено инактивирующее экспрессию метилирование CpG-островков в промоторных районах ряда кандидатов в TSG на хромосоме 3 [5, 6]. В то же время мутации в генах из критического района LUCA (3p21.31) наблюдали с частотой ниже 10% [7]. Предполагают, что поиск метилированных генов или фрагментов ДНК более эффективен для выявления новых генов, связанных с канцерогенезом, чем анализ мутаций в генах-кандидатах [7, 8]. Более того, анализ метилирования промоторных районов известных TSG предлагают использовать в качестве новых онкомаркеров для молекулярной диагностики и прогноза онкологических заболеваний [9, 10].
За последние несколько лет на коротком плече хромосомы 3 человека открыто более 10 TSG, в том числе кластер связанных с канцерогенезом генов в районе перекрывающихся гомозиготных делеций (HD) LUCA, 3p21.31 [5-7]. Установлено снижение экспрессии гена RASSF1A, локализованного в этом кластере, в линиях опухолевых клеток и в первичных опухолях разной локализации, корреляция инактивации транскрипции этого гена с метилированием CpG-островков промо-торного района, а также способность к подавлению опухолевого роста [11-15]. Показано, что ген RASSF1A связан с регуляцией клеточного цик-
ла и инициацией апоптоза [6, 15]. Предполагают, что метилирование промоторного района этого гена представляет собой одно из ранних событий в канцерогенезе ЯСС [12]. С другой стороны, описана положительная корреляция между эпигенетической модификацией этого гена на ранних стадиях аденокарциномы легкого и вероятностью летального исхода [16].
В предлагаемой работе представлены результаты изучения метилирования промоторного района гена ЯЛ88Е1Л в трех видах эпителиальных опухолей (ЯСС, ВС и ОЕТ) с использованием комбинации методов. Определена частота метилирования промоторного района (т.е. доля образцов, в которых наблюдали метилирование), статус метилирования 18 Срв-пар и плотность метилирования Срв-островка.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Образцы опухолевой и прилежащей гистологически нормальной ткани собраны и клинически охарактеризованы в РОНЦ РАМН. Использовали ткани только тех больных, которые до операции не получали химио- или лучевую терапию. Все случаи ЯСС, ВС и ОЕТ классифицированы клинически по системе ТКМ в соответствии с требованиями Международного противоракового общества (ШСС, версия 1998 г.) и типированы гистологически на основании классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) [17-19]. Нами изучены 63 образца светлоклеточ-ного ЯСС, 59 - ВС протоковой и дольковой гистологии и 50 образцов ОЕТ с гистологией разных типов, включая две доброкачественные опухоли и пять пограничных. Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов (толщина 3-5 мкм), окрашенных эозином и гематоксилином. Отбирали образцы с содержанием опухолевых клеток не менее 70%. Образцы
Рис. 1. Нуклеотидная последовательность промоторного района гена КЛЗЗЕ1Л. Выделены жирным и пронумерованы 32 Срв-пары. На темном фоне показаны номера проанализированных с помощью МЧРА 18 Срв-пар
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.