ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.821.6+615+616-092.9+ 616.89-008.454
УРОВЕНЬ МОНОАМИНОВ И ИХ МЕТАБОЛИТОВ В СТРУКТУРАХ МОЗГА КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ТРЕВОЖНО-ДЕПРЕССИВНЫМ СОСТОЯНИЕМ, ВЫЗВАННЫМ ВВЕДЕНИЕМ ИНГИБИТОРА ДИПЕПТИДИЛПЕПТИДАЗЫ IV В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ПЕРИОДЕ
© 2012 г. Е. Ю. Кушнарева1, Н. А. Крупина1, *, Н. Н. Хлебникова1, В. С. Кудрин2,
Н. Н. Золотов2, Г. Н. Крыжановский1
Учреждение Российской АМН НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва 2Учреждение Российской АМН НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, Москва
На модели экспериментального тревожно-депрессивного состояния, вызванного постнатальным введением ингибитора ДП-1У, изучены особенности обмена ДА, НА и 5-ОТ в структурах головного мозга крыс в возрасте 1, 3 и 7 мес. У самцов на всех сроках обследования основные изменения функциональной активности ДА-системы, связанные со снижением оборота ДА по показателю ГВК/ДА, выявлены в стриатуме. В позднем возрасте у самцов выявлено увеличение уровня НА в гипоталамусе. У самок основные изменения состояния ДА-системы проявлялись в снижении уровня ДА и его метаболитов в прилежащем ядре (1 и 3 мес.), уровня ДОФУК в гипоталамусе (3 мес.) и уровня ДА в стриатуме (7 мес.). На всех сроках обследования в гиппокампе у самок обнаружено повышение функциональной активности 5-ОТ-системы по показателю 5-ОИУК/5-ОТ и уровню 5-ОИУК. Во фронтальной коре у самок в возрасте 3 мес. выявлено снижение отношения 5-ОИУК/5-ОТ и увеличение отношения ДОФУК/ДА, а в возрасте 7 мес. — повышение уровня 5-ОТ. Выявленные изменения в активности центральных моноаминергических систем могут отражать особенности функционирования патологической системы тревожно-депрессивного состояния в ЦНС, определяющие характер формирования и динамику эмоционально-поведенческих нарушений у самцов и самок крыс.
Ключевые слова:модель, тревожно-депрессивное состояние, ингибитор дипептидилпептидазы IV, крысы, мозг, моноамины и их метаболиты.
ВВЕДЕНИЕ
Нарушение функциональной активности основных моноаминергических систем мозга и их взаимодействия, нарушения в системах транспортеров и рецепторного связывания моноаминов в течение долгого времени рассматриваются в качестве ведущих патофизиологических механизмов развития аффективных расстройств, включая депрессивные состояния и тревогу [1—3]. В генезе эмоционально-мотивационных нарушений наиболее полно изучено участие центральных серото-нинергической (5-ОТ-ергической), норадренер-гической (НА-ергической) и дофаминергической (ДА-ергической) нейротрансмиттерных систем. Как правило, развитие депрессии связывают с недостаточностью этих систем [1, 4], а возникновение тревожных расстройств — с увеличением активности центральной НА-ергической системы и дисфункцией 5-ОТ-системы, которая может вести
*Адресат для корреспонденции: 125315, Москва, Балтийская ул., 8, e-mail: krupina-na@yandex.ru.
к дизрегуляции других нейротрансмиттерных систем [2, 5].
Коморбидность тревожных и депрессивных состояний подтверждена во многих исследованиях [6—8]. Больные с сочетанным состоянием тревоги и депрессии характеризуются более тяжелым течением заболевания, худшим прогнозом по сравнению с пациентами, страдающими только депрессией или тревожностью, особой устойчивостью к терапии общепринятыми лекарственными средствами [9]. Однако до настоящего времени нет ясных представлений о том, как изменяется функциональная активность моноаминергических систем мозга в динамике развития тревожно-депрессивных расстройств. Поиск ответа на этот вопрос предполагает сопоставление данных клинических исследований и модельных экспериментов.
В недавних работах на грызунах с инактивацией гена дипептидилпептидазы IV (ДП-1У, ЕС 3.4.14.5, СЭ26, сериновая пролинспецифическая пепти-даза) было обнаружено, что эта пептидаза вовлечена в патогенез депрессии и тревожности [10—12]. В нашей работе мы показали, что новый неконку-
35
3*
рентный синтетический ингибитор ДП-1У метио-нил-2(8)-цианопирролидин в условиях его введения в раннем постнатальном периоде крысам стабильно вызывает развитие тревожно-депрессивного состояния у крыс подросткового и зрелого возраста [13, 14]. Крысы обоего пола демонстрировали сочетание симптомов тревожности и депрес-сивности в поведении, причем, как правило, в онтогенезе интенсивность тревожности и депрессивно-подобных нарушений изменялась вплоть до смены преобладающего аффекта. Динамика развития экспериментального тревожно-депрессивного состояния у крыс, подвергнутых введению ингибитора ДП-1У в раннем постнатальном периоде, позволила сопоставить выявленные эмоцио-нально-мотивационные нарушения с клинической симптоматикой смешанного тревожно-депрессивного состояния [8].
Цель настоящего исследования заключалась в изучении особенностей обмена ДА, НА и 5-ОТ в структурах головного мозга крыс с экспериментальным тревожно-депрессивным состоянием, вызванным постнатальным введением ингибитора ДП-1У.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена на белых крысах обоего пола популяции Вистар (п = 91), выращенных в виварии УРАМН НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН. На протяжении исследования животные содержались в стандартных условиях вивария группами по 5—7 крыс, с естественной сменой освещенности и свободным доступом к пище и воде, за исключением периодов тестирования на потребление жидкости и предпочтение/потребление сахарозы.
Все процедуры и эксперименты на животных проводили в соответствии с "Правилами лабораторной практики в Российской Федерации", утвержденными приказом Министерства здравоохранения РФ № 267 от 19.06.2003 г., и директивой ЕС 86/609/ЕЕС о гуманном обращении с животными (ревизия от 14.11.2005).
Состояние моноаминергических систем изучено в 2 экспериментальных сериях (серия I: п = 33, серия II: п = 58). В каждой серии половине животных (опытные группы) в раннем постнатальном периоде (5—18 дни включительно) вводили синтетический ингибитор ДП-1У неконкурентного типа метионил-2(8)-цианопирролидин (Ме^Ргё-^ синтезирован в УРАМН НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, константа ингибирова-ния по субстрату Gly-Pro-7-амино-4-кумарила-миду составляет 2.7 нмоль/л) в дозе 1.0 мг/кг, вну-трибрюшинно, в объеме 0.1 мл на 10 г массы тела. Использовали свежеприготовленный раствор Ме^Ргё^ (субстанцию растворяли добавлением
1—2 капель Твина-80 и разводили физиологическим раствором до требуемого объема). Второй половине крысят (контрольные группы) по той же схеме вводили физиологический раствор. В возрасте около 1 мес. крысят отделяли от матери и формировали опытные и контрольные группы животных из крысят одного пола с примерно равным числом особей таким образом, чтобы в состав каждой опытной и контрольной группы входили детеныши из 3—4-х пометов. В возрасте 1, 2, 3 мес. (сер. I и II) и 7 мес. (сер. I) поведение крыс оценивали в тестах на тревожность и депрессивность (методы оценки эмоционально-мотивационного поведения и результаты обследования подробно описаны в работах [13, 14]). В возрасте 1 мес. (сер. II), 3 мес. (сер. II) и 7 мес. (сер. I) у этих же животных оценивали состояние моноаминерги-ческих систем в структурах мозга. По окончании поведенческого тестирования крыс декапитиро-вали и под визуальным контролем на льду немедленно выделяли фронтальную кору и подкорковые структуры: гипоталамус, стриатум, прилежащее ядро, гиппокамп. Полученные образцы ткани разделяли на две примерно равные части, одну из которых использовали для определения активности пролинспецифических пептидаз (результаты в настоящей статье не приводятся), другую, предназначенную для определения уровня моноаминов, сразу помещали в жидкий азот и хранили в нем до начала процедуры измерения.
Уровень моноаминов и их метаболитов в структурах мозга крыс определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ионпар-ная хроматография) с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД) на хроматографе LC-304T (BAS, West Lafayette, США) с инжектором Rheodyne 7125, петля для нанесения образцов 20 мкл [15]. Изучаемые вещества разделяли на обращенно-фазной колонке ReproSil-Pur, ODS-3, 4 х 100 мм, размер частиц 3 мкм (Dr. Majsch GMBH, "Элсико", Москва). Насос PM-80 (BAS, США), скорость элюции подвижной фазы 1.0 мл/мин, при давлении 2 атм. Мобильная фаза: 0.1 M цитратно-фос-фатный буфер, содержащий 1.1 mM октансульфо-новой кислоты, 0.1 mM ЭДТА и 9% ацетонитрила (pH 3.0). Измерение проводили на стеклоугольном электроде (+0.85 V) против электрода сравнения Ag/AgCl. Подвижную фазу фильтровали с помощью вакуумного насоса через целлюлозные фильтры (диаметр пор 0.2 мкм) при Р = 20—40 мм Hg столба и перед каждым хроматографическим определением тщательно дегазировали под вакуумом с одновременной обработкой на ультразвуковой бане ("Серьга", Россия) в течение 40—50 с. Для определения количества моноаминов в структурах мозга крыс использовали раствор, содержащий в качестве внутреннего стандарта диоксибензиламин (ДОБА), норадреналин (НА), Ь-3,4-дигидрокси-фенилаланин (ДОФА), 3,4-дигидроксифенилук-
Таблица 1. Изменение уровня тревожности и депрессивности у крыс-самцов, подвергнутых введению ингибитора дипептидилпептидазы IV метионил-2(8)-цианопирролидина в раннем постнатальном периоде
Изменение эмоционально-мотивационного поведения в тестах
Возраст животных
1 мес. 2 мес. 3 мес. 7 мес.
сер. I сер. II сер. I сер.II сер. I сер.II сер. I
Приподнятый крестообразный лабиринт (снижение поведенческой активности в открытых рукавах лабиринта)
Комплексный многопараметровый метод интегральной оценки тревожно-фо-бических состояний у крыс
"Открытое поле" (увеличение латентного периода выхода из центра)
Принудительное плавание ("поведенческое отчаяние", ритмологические нарушения)
Предпочтение/потребление сахарозы (агедония)
Потребление жидкости (снижение питьевой мотивации)
Тревожность
+
+
+
+
Депрессивность
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Примечание к табл. 1: + увеличение уровня тревожности/депрессивности; = статистически значимых отличий от соответствующего контроля не обнаружено.
сусную кислоту (ДОФУК), дофамин (ДА), гомова-нилиновую кислоту (ГВК), 5-гидрокситриптофан (5-ОТФ), 5
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.