ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 3, с. 293-296
УДК 577.21
УСИЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ХИМЕРНЫХ ГЕНОВ ВКЛЮЧЕНИЕМ В ИХ 3-НЕТРАНСЛИРУЕМУЮ ОБЛАСТЬ ИНТРОНА 2 ГЕНА БЕТА-ГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА
© 2014 г. А. П. Переверзев*, Н. М. Маркина*, **, Ю. Г. Янушевич**, Т. В. Городничева**, Б. Э. Минасян**, К. А. Лукьянов*, Н. Г. Гурская*, #
*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997ГСП, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
**ЗАО Евроген 117997ГСП, Москва, В437, ул. МиклухоМаклая, 16/10 Поступила в редакцию 04.10.2013 г. Принята к печати 25.11.2013 г.
Исследована возможность увеличения гетерологичной экспрессии в клетках млекопитающих при включении интронов в З'-нетранслируемую область соответствующего гена. Для этого в экспресси-онный вектор, содержащий ген флуоресцентного белка TagGFP2, вводили интрон 2 гена Р-глобина человека. Данная последовательность встраивалась после стоп-кодона TagGFP2 на расстоянии 35 нт. от стоп-кодона до сайта сплайсинга. Это позволило избежать процесса нонсенс-опосредованной деградации мРНК. Использование второй рамки считывания, кодирующей красный флуоресцентный белок Katushka, позволило нормировать уровень трансфекции и экспрессии химерных конструкций. Проточная цитофлуориметрия культуры клеток HEK293T, временно трансфициро-ванных генетическими конструкциями, содержащими и не содержащими интрон, позволила выявить увеличение интенсивности флуоресценции в зеленом канале для конструкции с интроном в 1.8 ± 0.2 раза относительно контрольной безинтронной конструкции. Аналогичное усиление уровня экспрессии в 1.7 ± 0.2 раза при наличии интрона 2 Р-глобина 3'-нетранслируемой области было показано также для гена, кодирующего дестабилизированный вариант флуоресцентного белка TurboYFP. Эффект увеличения уровня экспрессии химерных конструкций в клетках млекопитающих введением интрона в 3'-нетранслируемую область целевого гена можно использовать в различных модельных системах, где введение 5'-концевого интрона в последовательность является неприемлемым.
Ключевые слова: флуоресцентный белок, интрон, в-глобин человека, NMD, 3'-нетранслируемая область химерных генов, проточная цитофлуориметрия.
DOI: 10.7868/S0132342314030117
ВВЕДЕНИЕ
Характерной чертой большинства эукариоти-ческих генов является наличие в них одного или более, иногда десятков, интронов, которые должны быть вырезаны для получения зрелых мРНК [1]. При этом установлено влияние интронов и их вырезания на многие аспекты метаболизма РНК, такие как полиаденилирование пре-мРНК, экспорт мРНК из ядра и ее распад [2]. Эти эффекты могут привести к разному уровню экспрессии содержащих интроны и безинтронных вариантов генетических конструкций [3, 4].
Для увеличения гетерологичной экспрессии генетических конструкций предложено включать интроны в 5'-нетранслируемую область химерных генов [5—7], а также непосредственно в коди-
Автор для связи (тел.: +7 (499) 724-81-22; эл. почта: ngurskaya@mail.ru).
рующую последовательность гена [8]. При этом экспрессия, как правило, усиливается в 2—10 раз [9], а в некоторых случаях может составлять и большую величину [10].
Механизм опосредованного интронами усиления экспрессии до сих пор не ясен [9]. Предложенная недавно модель, объясняющая данный феномен, предполагает, что усиление экспрессии не должно зависеть от места расположения интрона в пре-мРНК [11]. Из литературных данных известно, что интрон 2 гена Р-глобина необходим для его экспрессии в гетерологических условиях [12]. Для поддержания высокого уровня экспрессии в- и у-глобинов в трансгенных организмах необходимо наличие АТ-богатой последовательности интрона 2, с которой связывается ряд транскрипционных факторов [13].
Однако в литературе, напротив, описано либо явление ослабления экспрессии генетических
294
ПЕРЕВЕРЗЕВ и др.
конструкций при введении различных сплайси-руемых интронов в З'-нетранслируемую область химерных генов [14], либо отсутствие эффекта усиления экспрессии [9, 15].
В некоторых случаях включение интронов в З'-нетранслируемую область химерных генов может приводить к деградации синтезированных молекул мРНК под действием нонсенс-опосредованной деградации РНК (Nonsense-Mediated Decay, NMD) [16, 17]. У млекопитающих в большинстве генов стоп-кодон расположен в последнем экзоне, и стоп-кодоны, расположенные на расстоянии >50 нт. до последнего места соединения экзонов, распознаются как преждевременные. Механизм распознавания основан на взаимодействии рибосомы с белковым комплексом EJC, связывающимся с мРНК вблизи места соединения экзонов [18]. Если стоп-кодон распознается как преждевременный, молекула мРНК расщепляется вовлеченными в процесс NMD белками. Как правило, в результате процесса NMD уменьшается количество РНК-субстрата в клетках в 5—20 раз [19, 20]. В таком случае при введении интрона в З'-нетранслируемую область гена эффект усиления экспрессии будет скомпенсирован процессом распада мРНК, что может привести к неверной интерпретации эффекта включения интронов в З'-нетранслируемую область химерных генов.
Описан процесс активации криптических акцепторных сайтов сплайсинга внутри кодирующей последовательности химерного гена под действием интрона в 5'-нетранслируемой области, приводящий к сбою рамки считывания [21]. Это делает предпочтительным введение усиливающего экспрессию интрона в З'-нетранслируемую область химерного гена.
Целью настоящей работы было исследовать возможность увеличения гетерологичной экспрессии белков при включении интронов в З'-не-транслируемую область химерного гена. При этом мРНК химерного гена с интроном в З'-неко-дирующей области конструировали устойчивой к NMD, оставляя менее 50 нт. между стоп-кодоном и донорным сайтом сплайсинга интрона.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для экспериментальной проверки влияния сплайсируемого интрона в З'-нетранслируемой области гена на уровень экспрессии кодируемого белка мы создали генно-инженерные конструкции для независимой экспрессии двух генов в клетках млекопитающих. Конструкции несли два кодирующих флуоресцентные белки гена, каждый из которых включал ранний промотор цито-мегаловируса и ранний сигнал полиаденилирова-ния вируса SV40. Первый ген кодировал дальне-красный флуоресцентный белок Katushka [22]; был использован вариант этого гена, лишенный
потенциальных сайтов сплайсинга [23]. Второй ген кодировал зеленый флуоресцентный белок TagGFP2 и дополнительно содержал после стоп-кодона TagGFP2 фрагмент гена ß-глобина человека, несущий интрон 2 (вектор "Int+"), или соответствующую сплайсированную безинтронную последовательность мРНК ß-глобина (вектор "Int-"). После сплайсинга последовательности обеих мРНК, кодирующих белок TagGFP2, были идентичны. Так как расстояние между стоп-кодоном кодирующей последовательности и местом соединения экзонов фрагмента гена ß-глобина составляло 35 нт., мРНК Int+ была устойчива к NMD и данный процесс не влиял на экспрессию TagGFP2. Транскрипт, кодирующий белок Katushka, использовали для нормирования эффективности трансфекции и уровня экспрессии в клетках, так как белки Katushka и TagGFP2 дают хорошо спектрально различимые флуоресцентные сигналы [24]. Таким образом, флуоресцентный сигнал TagGFP2, нормированный на интенсивность флуоресценции Katushka, позволял судить о влиянии присутствия интрона в З'-нетранслируемой области Int+ на экспрессию TagGFP2.
Клетки, трансфицированные конструкцией с геном Int+, обладали в 1.8 ± 0.2 раза более высокой нормированной флуоресценцией в зеленом канале по сравнению с клетками, трансфициро-ванными конструкцией Int- (рисунок). Следовательно, введение интрона ß-глобина в З'-нетранс-лируемую область химерного гена усиливало его экспрессию.
Наблюдаемый эффект был использован для усиления экспрессии дестабилизированного варианта флуоресцентного белка TurboYFP (TurboYFP-dest) с высокой скоростью деградации в клетках, используемого для отслеживания быстрых изменений активности промоторов. Белок TurboYFP дестабилизирован слиянием с фрагментом последовательности орнитиндекарбоксилазы (аминокислотные остатки 422—461, так называемый мотив PEST), обеспечивающим быструю деградацию TurboYFP с периодом полураспада 1—1.5 ч и низкую концентрацию при экспрессии в клетках млекопитающих [25].
Фрагмент гена ß-глобина, несущий интрон 2, клонировали в вектор после кодирующей последовательности белка TurboYFP-dest. Полученными конструкциями и исходными конструкциями без интрона временно трансфицировали клетки HEK293T Анализ клеток через 24 ч после трансфек-ции методом проточной цитофлуорометрии показал, что средняя интенсивность флуоресценции клеток, содержащих вектор с последовательностью ин-трона, в 1.7 ± 0.2 раза выше относительно клеток, несущих исходную конструкцию TurboYFP-dest без интрона.
Мы считаем, что показанный в настоящей работе метод может быть использован для увеличения уровня экспрессии в гетерологических системах в
УСИЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ХИМЕРНЫХ ГЕНОВ
295
Рисунок. Результаты проточной цитофлуориметрии клеток, временно трансфицированных векторами Int- (слева) или Int+ (в центре). Каждая точка на бивариантном плоте показывает интенсивность флуоресценции клетки в зеленом (горизонтальная шкала) и красном (вертикальная шкала) каналах детекции. Для удобства сравнения клеточных популяций между собой середина "диагонали" клеток Int- показана пунктирной линией, а клеток IntH— сплошной линией. На панели справа представлено сравнение середин "диагоналей" распределения клеточных популяций Int- и Int+.
тех случаях, когда включение интронов в 5'-не-транслируемую область гена является неприемлемым (например, в случае наличия в кодирующей части гена акцепторных сайтов сплайсинга).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Генно-инженерные манипуляции и культивирование клеток производили в соответствии со стандартными протоколами. Фрагмент ДНК, кодирующий ß-глобин человека, амплифицировали с помощью праймеров (5'—3') GTGGTGAGGC-CCTGGGCA и ATGTTTTTTATTAGGCAGAATCC на матрице геномной ДНК человека. Амплифици-рованный фрагмент ДНК использовали для второй амплификации со специфическими праймерами,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.