БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 2, с. 182 - 189
УДК 577.15.3
УСКОРЕНИЕ АГРЕГАЦИИ БЕЛКОВ В УСЛОВИЯХ ТЕПЛОВОГО СТРЕССА ПОД ВЛИЯНИЕМ ФАКТОРА ИНГИБИРОВАНИЯ МИГРАЦИИ МАКРОФАГОВ*
© 2006 г. О.А. Черепкова, Е.М. Лютова, Т.Б. Еронина, Б.Я. Гурвиц**
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071 Москва, Ленинский пр., 33; факс: (7-495)954-2732, электронная почта: bella@inbi.ras.ru
Поступила в редакцию 14.05.05 После доработки 02.06.05
Исследовано влияние термостабильного гидрофобного белка (12,5 кДа) — фактора ингибирования миграции макрофагов (Macrophage migration inhibitory factor, MIF) на кинетику агрегации модельных белковых субстратов (гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика и дрожжевой алкогольдегидрогеназы) в условиях теплового стресса (41—48°). С использованием турбидиметрического метода впервые обнаружена антишаперонная активность MIF, проявляющаяся в значительном ускорении агрегации белков и увеличении предельного значения кажущегося поглощения при 360 нм при t ^ да в субстехиометрическом диапазоне концентраций MIF; показан кооперативный характер кинетики агрегации. На примере агрегации алкогольдегидрогеназы при температуре, близкой к физиологическому уровню (41,5°), продемонстрирована возможность обратимости процесса агрегации после снятия денатурирующего воздействия, обусловленная растворимостью агрегатов и стабилизацией олигомерной структуры субстрата в результате связывания MIF с частично денатурированным белком. Предположено, что, несмотря на выраженный антишаперонный эффект, в случае снятия теплового стресса и возврата системы к нормальному состоянию, MIF может играть шапероноподобную роль.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фактор ингибирования миграции макрофагов, шапероны, антишапероны, глико-генфосфорилаза b, алкогольдегидрогеназа, агрегация, тепловой стресс.
Молекулярные шапероны обладают способностью защищать белки, утратившие нативную конформацию при стрессорных воздействиях различного характера. Эта способность проявляется при взаимодействии шаперонов с гидрофобными участками развернутых или неправильно свернутых белков, что препятствует связыванию этих белков между собой и последующей агрегации и приводит, в конечном итоге, к сохранению их на-тивного состояния. Шапероны участвуют в различных внутриклеточных процессах, в том числе в котрансляционном фолдинге полипептидных цепей при их биосинтезе, транслокации белков через мембраны, включении индивидуальных белков в надмолекулярные структуры [1—3].
При температурах, превышающих физиологический уровень, в клетках всех организмов наблюдается активация синтеза молекулярных шаперонов, известных как белки теплового шо-
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 05-126, 23.10.2005.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ка (heat shock proteins, HSP). Некоторые из них (HSP70, GroEL) способствуют рефолдингу белков, подвергнутых тепловому повреждению, к нативному состоянию, в то время как другие (а-кристаллин, малые HSP) тормозят агрегацию белков и стабилизируют их структуру, однако, не участвуют в их рефолдинге [4—8]. Белковые агрегаты могут подвергаться солюбилизации и корректному рефолдингу с образованием биологически активной конформации под действием системы ATP-зависимых шаперонов и коша-перонов, входящих в состав мультишаперонной сети. В эту сеть часто вовлекаются ферменты фолдинга (пептидил-пролил-цис-транс-изоме-раза и протеиндисульфидизомераза) и различные шапероноподобные белки [4, 5, 9—13].
Большой интерес к изучению механизмов действия молекулярных шаперонов вызван не только проблемами, связанными с процессами агрегации при получении рекомбинантных белков, но и с необходимостью разработки эффективных средств защиты клеток в условиях развития патологических состояний в результате нарушения конформации белков.
В связи с многообразием и широким спектром действий шаперонов в различных компарт-ментах клетки интерес к ним не ослабевает, и список вновь открываемых шапероноподобных белков неуклонно растет. Однако, несмотря на огромное число экспериментов, направленных на изучение защитной роли шаперонов при денатурации белков в условиях стресса, молекулярные механизмы действия шаперонов остаются невыясненными.
Во многих случаях исследование данных процессов in vitro осложняется тем, что результаты действия шаперонов в значительной степени зависят от экспериментальных условий (характеристики белкового субстрата и шаперона, сте-хиометрических соотношений, температуры, состава буфера, формы и размеров агрегатов, их растворимости и др.), изменения которых могут радикальным образом отражаться на способности шаперонов предотвращать агрегацию белковых субстратов [14]. При определенных условиях наблюдается парадоксальная для ша-перонов способность ускорять агрегацию белков, находящихся в условиях стресса, которая была названа антишаперонной активностью [15].
Все известные в настоящее время шапероны обладают общими свойствами: они имеют гидрофобные домены, экспонированные на поверхности их молекулярных структур, способные узнавать и связывать определенные интермеди-аты фолдинга белковых субстратов. Однако структурно-функциональные особенности, необходимые для характеристики белка как шапе-рона, не вполне ясны.
В этой связи большой интерес вызывает исследование шапероноподобных свойств термостабильных гидрофобных белков. Один из таких белков — фактор ингибирования миграции макрофагов (macrophage migration inhibitory factor, MIF) известный как цитокин, обнаружен около 40 лет назад. MIF был идентифицирован как фактор, продуцируемый активированными Т-лим-фоцитами, по его способности тормозить миграцию макрофагов in vitro [16, 17]. В последующие годы было показано, что низкомолекулярный высококонсервативный белок MIF (12,5 кДа) широко распространен в биологических объектах разной степени сложности (от бактерий до млекопитающих), его наибольшее количество обнаружено в макрофагах и в различных отделах мозга. Далее MIF был вновь «открыт» как гормон передней доли гипофиза [18] и медиатор системного ответа организма на стресс [19, 20]. Обнаружено участие MIF на всех уровнях функционирования стрессиндуцируемой гипо-таламо-гипофизарно-адреналовой системы [19, 21, 22].
На основании структурно-функциональных характеристик MIF было предположено его участие в биохимических механизмах формирования защитных реакций организма при тепловом шоке, приводящем к денатурации и агрегации лабильных белков. Целью настоящей работы является изучение влияния MIF, выделенного из мозга быка, на агрегацию модельных белковых субстратов — фосфорилазы b (Ph b) из скелетных мышц кролика и дрожжевой алко-гольдегидрогеназы (ADH) в тест-системе in vitro, основанной на исследовании кинетики тепловой агрегации данных белков.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы. Использовали: Tris, Hepes, a-D-глюкозо-1-фосфат, БСА, стандарты молекулярной массы и и-гидроксифенилпируват (HPP) («Sigma», США); ADH и 5'-AMP («ICN Biomedicals Inc.», США); акриламид, ^№-мети-ленбисакриламид и персульфат аммония («Serva», Германия); HW-55 Toyopearl («TOYO SODA», Япония); все другие реактивы марки х.ч. или ч.д.а. (Россия). Использовали воду, деиони-зованную с помощью аппарата Milli Q System («Millipore», США).
Выделение MIF из мозга быка. Применяли метод, использованный нами ранее [23, 24] с небольшими модификациями. Мозг, полученный на мясокомбинате, замораживали и хранили в течение длительного времени при —70°. Перед выделением ткань размораживали и гомогенизировали в гомогенизаторе типа Waring blender в соотношении 3 : 1 (по объему) в 100 мМ Tris-HCl-буфере, pH 7,8, содержавшем 100 мМ KCl, 5 мМ Р-меркаптоэтанол ф-ME) и 1 мМ фенилметил-сульфонилфторид. Гомогенат центрифугировали при 10 000 g в течение 30 мин. Затем суперна-тант центрифугировали при 60 000 g в течение 1 ч на центрифуге L7 («Beckman», США). Вторичный супернатант нагревали на водяной бане 20 мин при 58° с последующим центрифугированием при 60 000 g в течение 1 ч. Супернатант подвергали высаливанию сульфатом аммония до конечного насыщения 80%. Полученная суспензия сохранялась в течение длительного времени при 4°. После центрифугирования аликвоты суспензии белка в сульфате аммония при 12 000 g в течение 20 мин осадок растворяли в 20 мМ Tris-HCl-буфере, pH 7,0, и наносили на колонку с Toyopearl HW-55 (1,6 х 70 см), уравновешенную тем же буфером. Элюцию проводили со скоростью 0,6 мл/мин.
Фракции, содержащие MIF, идентифицировали по кето-енол-таутомеразной активности,
которую определяли по скорости образования енол-изомера из кето-изомера HPP как субстрата [25, 26], измеряя увеличение абсорбции при 330 нм на спектрофотометре DU 650 («Beckman»).
Выделение гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика. Ph b выделяли по методу [27], используя дитиотреитол вместо цистеина и проводя трехкратную перекристаллизацию фермента. Полученный препарат хранили при —20° в р-глицерофосфат-№ОН-буфере, pH 6,8, содержащем 50%-ный глицерин и 30 мМ p-ME. Далее раствор фермента диализовали при 4° против 80 мМ Hepes-буфера, pH 6,8, содержащего 0,2 мМ ЭДТА. Выход белка составлял 0,5 мг на 1 г сырой ткани. Концентрацию фосфорила-зы b определяли спектрофотометрически при 280 нм, используя коэффициент поглощения 13,2 для 1%-ного раствора белка [28].
Кинетика термоагрегации белковых субстратов. Для анализа термоагрегации ADH и Ph b использовали турбидиметрический метод в 20 мМ Tris-HCl-буфере, pH 7,0 и в 0,08 М Hepes-буфе-ре, рH 6,8, содержащем 0,2 мМ ЭДТА соответственно. Поскольку образование агрегатов белка сопровождается ростом мутности белковых растворов, за кинетикой агрегации следили по увеличению кажущегося поглощения при 360 нм в 1-сантиметровых кюветах с использованием спектрофотометра DU-650, снабженного тер-мостатируемым кюветодержателем. Буфер пре-инкубировали при заданной температуре (40—48°) в отсутствие или в присутствии различных концентраций MIF и процесс агрегации запускали путем добавления белкового субстрата. Значения кажущегося поглощения автоматически записывались каждые 2 мин в течение
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.