ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2004, № 8, с. 952-960
^ БИОЛОГИЯ ^^^^^^^^^^^^^^^^
ПОЧВ
УДК 631.417:661.183.2
УСКОРЕННОЕ МИКРОБНОЕ РАЗЛОЖЕНИЕ 3,4-ДИХЛОРАНИЛИНА В ПОЧВЕ В ПРИСУТСТВИИ АКТИВИРОВАННОГО УГЛЯ*
© 2004 г. Г. К. Васильева1, Л. П. Бахаева1, Е. Р. Стрижакова1, В. М. Мухин2
1Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, 142290, г. Пущино, Московской обл., ул. Институтская, 2 2НПО "Неорганика", г. Электросталь, Московской обл.
Поступила в редакцию 17.06.2003 г.
Показано, что в серой лесной почве разложение 3,4-дихлоранилина (ДХА) внесенным штаммом Рагасоссш йетшАеат при концентрации ксенобиотика выше 2900 мг/кг прекращается из-за токсичности химиката. Микроботоксическое действие определяется концентрацией химиката в почвенном растворе, которая зависит в основном от содержания равновесно-сорбированной фракции ДХА в почве (Фрс). Внесение активированного угля значительно ускоряет биодеградацию химиката за счет его перераспределения из равновесно в неравновесно-сорбированную фракцию (Фнс), которая также остается в основном доступной микробному разложению. Через 5 месяцев после внесения Р. ¿етшАсат и оптимальной марки и дозы угля в почву, сильно загрязненную ДХА (5000 мг/кг), обнаруживали лишь незначительные количества химиката. В этих образцах содержание фракции Фнс и связанного гидролизуемого химиката (Фсв) снижалось до 1 и 4% от исходного соответственно, тогда как в контрольной почве содержание ДХА снижалось лишь на 40%. Внесение минеральных удобрений и известкование опытных образцов почвы не приводило к реэмиссии химиката.
ВВЕДЕНИЕ
Биологическая очистка (биоремедиация) с помощью микроорганизмов-деструкторов считается наиболее перспективным методом для почв, загрязненных органическими химикатами. Известны примеры успешной биоремедиации почв, загрязненных пентахлорфенолом, хлорпрофамом, паратионом, 2,4,5-Т, полихлорбифенилами, лин-даном, хлор даном, нефтепродуктами [7]. Однако вследствие высокой токсичности многих химикатов применение этого метода еще весьма ограничено. Ранее нами был предложен подход, значительно расширяющий возможности биоремедиации сильно загрязненных почв [4, 13]. Он основан на одновременном внесении микроорганизмов-деструкторов на фоне сорбентов (в частности активированного угля), что снижает токсичность химиката для микроорганизмов и создает условия для его разложения. Предложенный подход дал хороший результат на практике при дезактивации почвы после аварийной утечки 17 тон пропанида [4, 13]. Предыдущая статья была посвящена изучению доступности и динамики микробного разложения ДХА, сорбированного активированными углями [1].
В данной работе поставлена цель изучить механизм ускоренной деградации ДХА Р. denitrificans, вносимыми в почву вместе с сорбентом. Предполагался дифференцированный подход к разным формам присутствующего в почве ксенобиотика с це-
*
Работа выполнена при поддержке гранта Минпромнауки Московской обл. и РФФИ грант < 01-05-97006.
лью выявления фракции, определяющей токсическое действие на микроорганизмы. Ставилась также задача определить степень очистки почвы этим методом и вероятность реэмиссии связанных остатков химикатов при внесении минеральных удобрений и известковании почвы. Одновременно предполагалось решить и практические задачи определения оптимальной дозы и марки сорбента.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
В экспериментах использовали химически чистые 4-хлоранилин (4ХА) и ДХА, а также промышленные активированные угли (АУ) серии "Аг-росорб": один гранулированный марки АГ-3 и два порошковых - СКТ-6А и РС. Удельная площадь поверхности углей 963, 1028 и 310 м2/г соответственно, максимальная поглотительная способность по отношению к ДХА 583, 472 и 364 мг/г соответственно (подробнее свойства АУ в [1]).
Штамм Р. denitrificans, способный расти на среде с ДХА и монохлоранилинами в качестве единственных источников углерода, азота и энергии, выращивали на жидкой минеральной среде (рН 7) следующего состава (в г/л): К2НРО4 - 7; КН2РО4 - 3; М§Б04 - 0.1 и 4-ХА - 0.2; дистиллированная вода.
Исследования проводили в лабораторных условиях с образцами пахотного слоя серой лесной суглинистой почвы (С орг 2.1%, рН 5.5), отобранной на территории опытно-полевой станции
ИФ-ХиБПП РАН. Ранее на данной территории ни хлоранилины, ни их производные пестициды в почву не вносились.
Фракционированный анализ почвы на содержание ДХА. В почве последовательно определяли содержание равновесно (Фрс)- и неравновесно сорбированного ДХА (Фнс), а также связанного гидролизуемого ДХА (Фсв). При анализе почву (1 г) или весь твердый остаток почвенной суспензии встряхивали со 100 мл дистиллированной воды на встряхивателе в течение 1 ч. Осадок отделяли центрифугированием при 5000 G в течение 20 мин, а супернатант использовали для определения Фрс. Далее осадок трижды экстрагировали 100 мл ацетона, и объединенный ацетоновый экстракт использовали для определения Фнс. Осадок переносили в колбу емкостью 300 мл, отгоняли остатки растворителя в токе воздуха и использовали для определения Фсв. Для этого почву количественно переносили в колбы Эрленмейера, заливали 100 мл 20%-ного раствора NaOH и кипятили смесь в течение часа с обратным холодильником, затем дистиллировали ДХА в приемник с 5 мл 6 н. HCl. В дистилляте определяли содержание образовавшегося в ходе гидролиза ДХА. В почвенной суспензии дополнительно определяли фракцию растворенного ДХА (Фраств) после отделения осадка центрифугированием. Определяли также исходное содержание экстрагируемого ДХА в почве путем прямой трехкратной экстракции ацетоном, как описано выше, минуя стадию водной экстракции.
Во всех экспериментах повторность определения ДХА 3-кратная. Анализ фильтратов и экстрактов на содержание ДХА проводили методом жидкостной хроматографии высокого давления на хроматографе Liquohrome фирмы "Radelkis" с детектором UV-VIS, снабженном хроматографичес-кой колонкой Nucleosil (USA), как описано в [1].
Содержание хлорид-ионов в почвенной суспензии определяли потенциометрическим методом с помощью потенциометра OP-264 (Раделкис, Венгрия) и хлорид-селективного мембранного электрода OP-Cl-7113D в паре с электродом сравнения 0P-7203 по методу [2]. Разность содержания хлорид-ионов в опытном и контрольном (без внесения ДХА) образцах характеризует степень дехлорирования ДХА, а следовательно, и степень его полного разложения (или минерализации). Основанием для этого является механизм микробной утилизации ДХА, при которой скорость-лимитирующим процессом является дигидрокси-лирование ароматического кольца с последующим его расщеплением, сопровождающимся быстрым дехлорированием [6].
Численность микроорганизмов-деструкторов хлоранилинов (МДХА) в почве определяли по периоду полуразложения субстрата, как описано в [3].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Изотерму сорбции ДХА почвой получали путем анализа равновесной концентрации ДХА в почвенной суспензии после встряхивания 1 г почвы со 100 мл водного раствора ДХА разной концентрации (30, 60, 100, 150, 220 и 300 мг/л) при комнатной температуре в течение 1 ч и отделения сорбента от раствора центрифугированием при 5000 в в течение 20 мин. Количество сорбированного вещества определяли по разности.
Насыщение почвы ДХА осуществляли встряхиванием 5 г почвы с 200 мл водного раствора ДХА концентрации 300 мг/л в течение часа. После отделения твердой суспензии от раствора (центрифугирование 20 мин. при 5000 в и декантирование супернатанта) твердый остаток сразу же использовали для изучения десорбции ДХА, а также для приготовления почвенной суспензии при изучении микробной доступности сорбированного почвой ДХА.
Десорбция ДХА из почвы. Почва, насыщенная ДХА выше описанным методом, многократно (до 12 раз) десорбировалась встряхиванием в течение 1 часа на встряхивателе с водой (по 100 мл), затем 3 раза ацетоном (по 200 мл) и, в конце концов, подвергалась щелочному гидролизу для определения связанного гидролизуемого ДХА, как описано выше в методе анализа почвы. Экстракцию повторяли до тех пор, пока количество десорбируемого ДХА в очередном экстракте не стабилизировалось на уровне 0.5% от исходного. В результате в почве последовательно определяли содержание ДХА, способного максимально извлекаться водой, затем ацетоном, а также связанный гидролизуемый ДХА.
Доступность сорбированного почвой ДХА для Р. denitrificans определяли в эксперименте с почвенной суспензией. Ее приготавливали из насыщенной ДХА почвы. К твердому остатку сразу после декантирования супернатанта приливали 100 мл 0.5 М нейтрального калий-фосфатного буфера и количественно переносили суспензию в колбы Эрленмейера на 250 мл. В каждую колбу (за исключением контрольных) вносили 1 мл суспензии Р. denitrificans (конечная концентрация 105 кл./мл) и инкубировали в стационарных условиях в темноте при 28°С. Периодически отбирали аликвоты (5-10 мл) надосадочной жидкости и определяли содержание выделившихся хлорид-ионов, а отдельные образцы целиком использовали для определения содержания Фраств, Фрс, Фнс и Фсв. Фракции равновесно-сорбированного ДХА условно отождествляли с водоэкстрагируемым, неравновесно-сорбированного - с ацетон-экстра-гируемым, а связанного-гидролизуемого - со связанным химикатом.
Для изучения микробной доступности связанного ДХА почвенный остаток после удаления ацетон-экстрагируемого химиката высушивали
на воздухе, заливали 100 мл нейтрального калий-фосфатного буфера, вносили суспензию Р. deni-МАсат (105 кл./г) и инкубировали в стационарных условиях в темноте при 28°С в течение 24 суток. Опытные и контрольные (не инокулирован-ные) образцы периодически анализировали на содержание фракций ДХА.
Влияние активированного угля на разложение ДХА в почве Р. denitrificans. В чашках Петри на поверхность почвы (50 г) вносили спиртовой раствор ДХА (исходная концентрация в почве 6250 мг/кг). После испарения спирта вносили активированный уголь СКТ-6А (1% по весу) - (вариант А), суспензию Р. denitrificans (конечная концентрация в почве 105 кл./г) - (вариант Б) или оба этих компонента (варианты А + Б). Контрольные образцы загрязненной ДХА почвы оставляли необработанными (вариа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.