МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 3, с. 313-320
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.22:579.852.11
УСЛОВИЯ БИОСИНТЕЗА ВНЕКЛЕТОЧНОЙ СУБТИЛИЗИНОПОДОБНОЙ ПРОТЕИНАЗЫ
BACILLUS PUMILUS KMM 62
© 2007 г. Л. А. Маликова*, А. М. Марданова*1, О. В. Соколова*, Н. П. Балабан*,
Г. Н. Руденская**, М. Р. Шарипова*
*Казанский государственный университет **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 11.08.2006 г.
Исследовано влияние условий культивирования на рост и эффективность продукции субтилизино-подобной сериновой протеиназы Bacillus pumilus KMM 62. Накопление фермента в культуральной жидкости достигает максимального значения на 32 и 46-48 ч роста и зависит от состава питательной среды. В многофакторных экспериментах подобрано оптимальное для биосинтеза фермента соотношение концентраций основных компонентов среды - пептона и неорганического фосфата. Соли аммония, внесенные в качестве дополнительного источника азота, по-разному влияют на биосинтез протеиназы в разные стадии роста: снижают продукцию фермента в ранней стационарной фазе роста и стимулируют биосинтез фермента через 46-48 ч роста. Сложные органические субстраты -альбумин, казеин, гемоглобин и желатин - оказывают репрессирующее действие на биосинтез фермента. Аминокислоты по-разному влияют на рост культуры и биосинтез фермента в раннюю и позднюю стационарную фазу роста. Наиболее выраженное репрессирующее действие на биосинтез оказывают гидрофильные аминокислоты - глутамин и глутаминовая кислота. Предполагается участие различных механизмов регуляции синтеза этой протеиназы в раннюю и позднюю стационарную фазу роста.
Ключевые слова: Bacillus pumilus, субтилизиноподобная протеиназа, биосинтез, условия роста и биосинтеза.
Бациллы продуцируют разнообразные внеклеточные ферменты, среди которых одной из наиболее изученных является многочисленная группа сериновых протеиназ - субтилаз, или субтилизино-подобных протеиназ [1]. Гены многих бациллярных субтилаз клонированы и секвенированы, для некоторых белков установлена пространственная структура [1-3]. Тем не менее до сих пор вопрос о функциональной роли внеклеточных субтилизи-ноподобных протеиназ и механизмах регуляции их биосинтеза остается открытым.
Культура Bacillus pumilus KMM 62 является продуцентом внеклеточной сериновой протеиназы. Ген сериновой субтилизиноподобной протеиназы B. pumilus клонирован и его последовательность се-квенирована [4]. Однако в литературе мало данных
0 закономерностях биосинтеза этого фермента, о влиянии различных экзогенных факторов на экспрессию гена этого белка.
Известно, что при переходе бактерий в стационарную фазу роста происходят глобальные измене-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: Ayslu.Mardano-va@ksu.ru).
ния клеточной физиологии и метаболизма, в частности, за счет изменений в аппарате транскрипции. Так, происходит индукция экспрессии большого количества генов, которые обеспечивают устойчивость к различным неблагоприятным условиям [5]. При переходе клеток в стационарную фазу происходит активация синтеза различных вторичных метаболитов, в частности гидролитических ферментов [6]. Синтез внеклеточных протеиназ бациллами в стационарную фазу роста, по-видимому, представляет собой одну из множественных реакций адаптации к неблагоприятным условиям среды.
Ранее было показано, что бактерии В. Мвгтвёи ш секретируют в среду сериновые протеиназы с максимальной активностью через 24 и 44-46 ч роста [7, 8]. С помощью рекомбинантных штаммов были исследованы закономерности биосинтеза суб-тилизиноподобного фермента и выявлены различия в синтезе этого белка в ранней и поздней стационарной фазе роста [9]. Представлялось интересным исследовать закономерности биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы В. ритИш КММ 62 в разные фазы роста культуры. Подбор оптимальных условий культивирования для получения
OD590 x 10, опт. ед;
споры, %; A, пмоль/мл ц, e, ч-1
6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 Время, ч
Рис. 1. Динамика роста культуры (1), удельной скорости роста ц (2), протеолитической активности (3), удельной скорости накопления протеиназы £ (4), и спорообразования B. pumilus KMM 62 (5).
максимального выхода субтилизиноподобной протеиназы B. pumilus является начальным этапом работы по выяснению механизмов биосинтеза и последующего препаративного получения этого фермента.
Целью работы являлось изучение закономерностей роста, спорообразования, биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы у B. pumilus KMM 62 и влияния различных экзогенных факторов на уровень накопления фермента в культуральной жидкости на разных этапах роста культуры бактерий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служил штамм Bacillus pumilus KMM 62, выделенный из морской воды (из коллекции кафедры микробиологии Казанского государственного университета).
Исходной питательной средой для культивирования служила среда следующего состава (г/л): пептон - 20, СаС12 ■ 2Н2О - 0.1, MgSO4 ■ 7Н2О - 0.3, NaCl - 3.0, MnSO4 - 0.1, Na2HPO4 ■ 12H2O - 0.3 г/л, рН 8.5 [7]. Среду стерилизовали при 1 атм. В многофакторных экспериментах пептон вносили в конечной концентрации 15-40 г/л. Растворы неорганического фосфата (Na2HPO4 ■ 12H2O), цитрата аммония (C5H7O5COONH4) и хлористого аммония (NH4C1) стерилизовали отдельно при 1 атм и вносили в среду перед посевом: неорганический фосфат - в конечной концентрации 0.1-0.4 г/л, соли аммония - в конечной концентрации 1-5 мМ.
Растворы казеина по Гаммерстену фирмы "Serva", альбумина, желатина и гемоглобина фирмы "Sigma" стерилизовали при 0.5 атм и вносили в среду в конечной концентрации 0.1, 0.5 и 1.0%. Растворы аминокислот (лейцин, триптофан, аспарагин,
глутамин, глутаминовая кислота) готовили и стерилизовали отдельно. Аминокислоты вносили в среду в конечной концентрации 0.1, 0.5 и 1.0%.
Соотношение объема колбы к объему среды 1 : 5. Посевным материалом служила 12-15-часовая культура (1 об. %). Культивирование проводили при температуре 37°С на вибростенде при 200 об/мин. Прирост биомассы определяли нефелометрически на ФЭК-56М при длине волны 590 нм. Количество биомассы выражали в единицах светопоглощения в кювете толщиной 1 см.
При изучении спорообразования использовали синхронную культуру, для получения которой 50-часовой инокулят подвергали кратковременному прогреву при 80°С в течение 30 с (5-6 раз). Для подсчета свободных спор препарат клеток окрашивали по Пешкову [10]. Количество свободных спор выражали в процентах по отношению к общему количеству вегетативных и спорулирующих клеток (100%), подсчет которых проводили в режиме фазово-контрастной микроскопии (микроскоп "Carl Zeiss" Jena Австрия) при увеличении в 1600 раз в 5-10 полях зрения.
Активность субтилизиноподобной протеиназы определяли по гидролизу хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNA по методу, описанному ранее [11]. За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 нмоль субстрата за 1 мин. Продуктивность культуры в отношении синтеза субтилизиноподобной протеиназы определяли как отношение величины протеолитической активности в культуральной жидкости к величине биомассы и выражали в условных единицах или процентах от величины продуктивности культуры на контрольной среде. Подсчитывали удельную скорость ц = dt In D и удельную скорость прироста
активности протеиназы £ = d-ln A.
Математическую обработку полученных данных проводили в программной среде Microsoft Excel путем расчета среднеквадратичного отклонения (g). Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении g < 15%. Результаты многофакторных экспериментов обрабатывали с помощью комплекса программ BIOPT [12].
РЕЗУЛВТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В культуральной жидкости B. pumilus нами идентифицирована протеиназа, гидролизующая синтетический субстрат Z-Ala-Ala-Leu-pNa, специфический для субтилизинов. Была исследована динамика роста культуры и накопления фермента в процессе культивирования (рис. 1). Максимальная скорость роста (0.28 ч-1) наблюдается в период от
14-го до 16-го ч культивирования. Фермент в следовых количествах обнаруживается в культураль-ной жидкости через 20 ч, после чего уровень его активности повышается, достигая двух максимумов, соответствующих 32 и 46-48 ч роста культуры (рис. 1). Наибольшая скорость накопления суб-тилизиноподобной протеиназы (е) наблюдается к 20-24 ч роста. Полученные результаты близки к ранее опубликованным данным по биосинтезу суб-тилизиноподобной протеиназы В. МвгтвЛш. В процессе культивирования этих бактерий также наблюдали два максимума накопления специфической ферментативной активности в культураль-ной жидкости, соответствующие 24-26 и 44-46 ч роста [7, 8]. Однако первый максимум накопления активности у В. ШвгтвсИш приходится на более ранние часы (24-26 ч) по сравнению с В. рытИш. Таким образом, первый максимум накопления протеолитической активности у В. рыт1Ы (32 ч) совпадает с началом стационарной фазы роста, а интенсивный синтез фермента происходит при замедлении роста культуры, что характерно и для других видов бацилл.
Второй максимум накопления внеклеточной протеиназы приходится на позднюю стационарную фазу роста и возникает вопрос о природе накопления этого белка в культуральной жидкости, корреляции этого процесса со спорообразованием культуры. Как видно из результатов исследования динамики спорообразования (рис. 1), через 32 ч от засева обнаруживается лишь 5% спор, через 46-48 ч роста число свободных спор невелико (не более 15%). Поэтому невозможно объяснить только лизисом клеток столь значительное увеличение внеклеточной протеолитической активности (уровень активности во втором пике примерно в 2 раза выше, чем в первом). Эти данные свидетельствуют о том, что субти-лизиноподобная протеиназа представляет собой секретируемый фермент и не накапливается в среде в результате лизиса. Однако момент повышения внеклеточной активности в фазе отмирания клеток (68-78 ч), видимо, совпадает с началом массового лизиса клеток и освобождением эндоспор. Ранее при изучении биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы у В. intermediыs с помощью
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.