ЖУРНАЛ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ, 2013, том 63, № 6, с. 656-666
ОБЗОРЫ, ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СТАТЬИ
УДК 612.821.6+612.822.3
УСОВЕРШЕНСТВОВАННАЯ ОПТИЧЕСКАЯ РЕГИСТРАЦИЯ НЕЙРОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ КРАСИТЕЛЕЙ
© 2013 г. Е. С. Никитин, Н. А. Асеев, П. М. Балабан
Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва,
e-mail: nikitin@ihna.ru Поступила в редакцию 18.07.2013 г.
Принята в печать 22.08.2013 г.
Изучение электрической активности и пластичности нейронных сетей, отдельных нервных клеток и их субклеточных компартментов на современном этапе невозможно без применения оптических методов визуализации функциональных сигналов, позволяющих регистрировать электрические события как во многих нейронах одновременно, так и в отдельных дендритах и аксонах, приводя им в соответствие точное морфологическое изображение. Применение потенциал-зависимых красителей (ПЗК) является единственным из малого числа доступных сегодня методов, сочетающим высокое пространственное разрешение с возможностью регистрации сверхбыстрых сигналов (<0.1 мсек) в реальном времени, и обеспечивающим высокое соотношение сигнал/шум. В последнее десятилетие произошел значительный прогресс в применении ПЗК, в особенности при анализе возникновения и кодирования электрических сигналов аксоном и дендритами, связанный с качественным совершенствованием метода при использовании наилучших красителей в комбинации с последовательным улучшением технических средств и оптического оборудования. Это позволило методу доказать свою полезность и эффективность и из чисто технической плоскости перейти в арсенал основных орудий ведущих лабораторий мира, проводящих исследования на переднем рубеже клеточной биологии и нейрофизиологии.
Ключевые слова: Нейрон, потенциал-зависимый краситель, визуализация, оптическая регистрация.
Advanced Optical Recording of Neuronal Activity with Voltage-Sensitive Dyes
E. S. Nikitin, N. A. Aseyev, P. M. Balaban
Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology of the Russian Academy of Sciences, Moscow, e-mail: nikitin@ihna.ru
Currently, the studies of electrical activity and plasticity of neuronal networks are impossible without employing of imaging techniques to visualize functional signals that allowing revealing electrical events in multiple neurons, as well as in their tiny dendrites and axons placed on their morphological picture. Imaging with voltage-sensitive dyes (VSD) is one of unique available methods that providing both high spatial resolution and ultrafast sampling (<0.1 ms) in realtime with perfect S-to-N ratio. During the last decade a significant progress in VSD application has been achieved due to major method improvements and new probe synthesis especially in the field of research of initiation and propagation of action potentials. There was evidence of the method efficiency and usability while the method was added to the toolbox of modern neuroscience for research in hottest topics.
Keywords: Neuron, voltage-sensitive dye, imaging, optical recording.
DOI: 10.7868/S0044467713060129
Оптическая регистрация с использованием ПЗК успешно используется с конца 80-х годов некоторыми лабораториями для отслеживания активности нейронов в реальном времени. Часто оптические методы применялись для получения данных, которые затруднительно или невозможно получить другим способом. Диапазон применения ПЗК варьирует от регистрации суммарных потенциалов для, например, картирования колонок дирекционной избирательности in vivo и до одновременной регистрации спайковой активности сетей многих отдельных нейронов, для регистрации потенциала в ком-партментах аксона и дендритных шипиках. Несмотря на десятилетия успешного применения [22], метод все еще остается методически и технически сложным и предъявляет высокие требования к подбору оборудования, четкой организации эксперимента и другим необходимым условиям для получения конечного результата. Кроме того, для проведения успешных исследований необходимо постоянное введение усовершенствований в методику как для адаптации ее под конкретную задачу или объект, так и привнося частные технические усовершенствования и улучшения, часто позволяющие добиться качественно новых результатов и увидеть более тонкие детали физиологических процессов, ранее остававшиеся неизвестными из-за недостаточной чувствительности метода. В этих условиях представляется особенно важным постоянно отлеживать технический прогресс в применении ПЗК, освещаемый в растущем числе публикаций ведущих мировых научных коллективов. В обзоре рассматриваются новые современные аспекты применения метода оптической регистрации с ПЗК в приложении к наиболее актуальным объектам и задачам современной нейрофизиологии.
ВЫБОР ОПТИМАЛЬНОГО ДИЗАЙНА УСТАНОВКИ ДЛЯ ОПТИЧЕСКОЙ РЕГИСТРАЦИИ
Ключевым моментом в процессе определения конкретной задачи эксперимента с применением ПЗК является выбор необходимого дизайна установки для решения фундаментальной проблемы исследования. В современной экспериментальной практике чаще всего используются две основные схемы установки оптической регистрации, имеющие очерченные неперекрывающиеся спектры применения и совершенствования со своими ограничениями, с трудом преодолимыми после того, как выбор сделан. Первой была схема, постро-
енная на использовании матрицы фотодиодов с параллельным усилением сигнала, поступающего от каждого элемента в отдельности. Практически установка на основе фотодиодной матрицы представляет собой набор независимых фотодиодов, собранных в матрицу и передающих сигнал от каждого диода своему усилителю, которые соединены с общим многоканальным аналого-цифровым преобразователем (АЦП). Такая схема имеет высокое разрешение по времени (до 0.2 мкс), меньшее пространственное разрешение (124 или 464 фоточувствительных элемента), среднюю чувствительность при высоком фотодинамическом диапазоне (рис. 1, А). Разрешение по времени ограничивается как свойствами красителя, так и допустимыми скоростями опроса фотодиодов для получения удовлетворительного отношения сигнал/шум [20]. Сигнал усиливается от каждого фотодиода параллельно, поэтому, например, установка с 124 диодами имеет 124 двухкаскадных усилителя, что добавляет сложности в конструкции и обслуживании. Из-за высокой чувствительности к вибрационным шумам (до 20 Гц) и механическим смещениям, модулирующим интенсивность проходящего света, микроскоп установки должен жестко крепиться к антивибрационному основанию комплекса микроманипуляторов или пневматическому антивибрационному столу
Сигнал, получаемый при регистрации электрической активности нейронных структур с применением абсорбционных красителей в проходящем свете, представляет собой суммацию мембранных потенциалов нейронов, проецируемых на фоточувствительные элементы матрицы [20, 55]. Подаваемый на препарат свет проходит сначала через тепловой фильтр, и далее через многослойный узкополосный фильтр с полосой пропускания ~720 ± 20 нм для получения максимального ответа. При этом увеличение количества проходящего света соответствует деполяризации нейронов, а уменьшение — гиперполяризации. От системы регистрации в проходящем свете не требуется большой чувствительности, так как проходящий свет обладает высокой интенсивностью, но критичны такие параметры, как широкий линейный диапазон и низкие собственные шумы диодной матрицы, усилителей и источника света.
Вторая схема построена на использовании CCD-камеры (Coupled Charged Device, рис. 1, Б) с последовательным опросом фотоэлементов. Такая схема имеет высокое пространственное разрешение (256000 элементов или
Фотодиодная
матрица
*
УСИЛЕНИЕ
ОБЪЕКТИВ ПРЕПАРАТ
f
КОНДЕНСОР
=£
7
ФИЛЬТР
Л)
V V
Обработка СИГНАЛА
?
СВЕТ
Б
CCD-камера
Дихроиче< зеркало
СВЕТ
ЭПИФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ
Рис. 1. Схема установки для оптической регистрации изменения прохождения света через объект (ДТ/Т, relative change in transmission) с помощью фотодиодной матрицы (А) при использовании эпи-флуоресценции (ДР/F, relative change in fluorescence) и CCD-камеры в качестве детектора (Б). Сигнал от CCD-камеры также усиливается и оцифровывается (не показано на рисунке). Подписи соответствуют частям оптического пути микроскопа с подключенным к нему устройством детекции. Fig. 1. Scheme of the imaging rigs for transmitted light recording (ДT/T, relative change in transmission) with a photodiode array (A), for fluorescence imaging with a CCD-camera (B). The signal from the CCD-camera is amplified and digitized (not shown). Legends on the panels indicate specific microscope parts of the light pathway with a detector attached.
более), высокое разрешение по времени (~1 мс; [18]; ~0.1 мс, [50]) и высокую чувствительность к слабым флуоресцентным сигналам. При применении флуоресцентных красителей для регистрации CCD-камерой полезный сигнал отражает относительное изменение флуоресценции (AF/F). Наибольшим разрешением по времени при максимально достижимом отношении сигнал/шум на сегодняшний день обладает интегрированная система RedShirtImaging Neuro CCD SMQ 80 x 80 пикселей (США, с возможностью регистрации 10 000 кадров в сек в режиме обрезки кадра до 12 x 80), которая фактически является наиболее распространенным стандартным обору-
дованием во многих лабораториях благодаря также удобной программной оболочке (Neu-roplex, OptImaging LLC, США) и интегрированным аппаратным и программным решениям для одновременного управления и синхронной регистрации оптофизиологических и электрических сигналов и стимулов. В комплект входит камера, оптический адаптер для установки на микроскоп (зависит от его модели) и обрабатывающий компьютер с АЦП, программным обеспечением и внешним боксом управления и синхронизации.
Кроме CCD-камеры, для регистрации флуоресценции также возможно использование конфокального микроскопа. Однако классиче-
ские конфокальные микроскопы мало подходят для регистрации сигналов ПЗК, поскольку не могут регистрировать достаточно сильный сигнал с большой скоростью из-за потери интенсивности при пропускании возбуждающего и отраженного света
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.