ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 1, с. 118-124
УДК 577.152.24:577.15.08
УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ МЕТОД ФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЦИКЛОДЕКСТРИНГЛЮКАНОТРАНСФЕРАЗЫ
© 2007 г. Н. Г. Усанов, Е. А. Гильванова, П. А. Елизарьев, Е. А. Пруцакова, А. И. Мелентьев
Институт биологии УНЦ РАН, г. Уфа, 450054; e-mail: nikusa@anrb.ru Поступила в редакцию 21.01.2006 г.
Усовершенствована методика спектрофотометрического определения активности циклодекстрин-глюканотрансферазы (ЦГТазы, КФ 2.4.1.19) с использованием в качестве окрашенного реагента фенолфталеина. Процедура включает в себя проведение ферментативной реакции в 2%-ном растворе крахмала при 40°С в течение 60 мин, внесение в реакционную смесь (0.5 мл) фенолфталеинового реагента (3.0 мл), приготовленного на основе 0.1 М калий-карбонатного буфера (рН 11.0) по особой методике и измерение оптической плотности полученной смеси при 553 нм. Активность вычисляли по формуле экспоненциального роста, связывающей величину падения оптической плотности относительно контроля и степень разведения фермента. Описываемый метод пригоден для работы в сравнительно широком диапазоне удельной активности Р-ЦГТазы и не требует точного подбора степени разбавления анализируемых растворов.
Циклодекстринглюканотрансфераза (ЦГТаза, КФ 2.4.1.19) катализирует реакцию трансформации крахмала, приводящую к образованию цик-лодекстринов (ЦД) - макроциклических олигоса-харидов, состоящих из a-D-глюкопиранозных остатков глюкозы, замкнутых а-1,4-связями в кольца. В результате ферментативной реакции одновременно образуются несколько олигосаха-ридов-гомологов, состоящих из шести-восьми остатков глюкозы и обозначаемых соответственно a-, ß- и у-циклодекстринами. Соотношение конечных продуктов реакции, как правило, зависит от штамма-продуцента ЦГТазы. Преимущественное образование, например ß-ЦД, происходит под действием ß-ЦГТаз, которые обнаруживаются у представителей родов Bacillus и Paeni-bacillus [1]. Характерными продуцентами a-ЦГТазы являются представители вида Paeniba-cillus macerans [1].
Спектрофотометрические методы определения активности ЦГТаз основаны на измерении величины экстинции растворов ряда красителей и индикаторов после внесения в них реакционных смесей, содержащих циклодекстрины, в свою очередь образующих бесцветные комплексы включения с окрашенным началом. Наибольшую чувствительность в отношение бета-циклодекс-трина проявляет фенолфталеин, обладающий малиново-пурпурной окраской в щелочных средах. С использованием растворов фенолфталеина по-
строена серия методов измерения активности в-ЦГТазы [2-6], катализирующей синтез преимущественно в-ЦД и имеющей наибольшее практическое значение [1]. Главной проблемой существующих методов является то, что окрашенный раствор фенолфталеина, готовят каждый раз непосредственно перед определением, дозируя рабочий раствор индикатора в этиловом спирте в щелочной натрий-карбонатный буфер. Получаемый окрашенный реагент неустойчив и меняет свою экстинцию, равно как и чувствительность к в-ЦД, в течение 1-3 ч экспозиции при комнатной температуре. Точность дозировки микроколичеств спиртового раствора фенолфталеина (летучая жидкость) также оставляет желать лучшего. Как результат, данные по определению активности одних и тех же препаратов ЦГТазы, полученных в разное время и в разных лабораториях, могут иметь существенные отличия (20-40% и более).
Цель работы - получение стабильного, стандартизованного по оптической плотности фенолфталеинового реагента, непосредственно готового к использованию в течение длительного времени, а также метода, адаптированного для простого и быстрого количественного определения в-ЦГТазы.
усовершенствованный метод фотометрического определения 119
МЕТОДИКА
Спектрофотометрические измерения. Выполняли в стеклянных кюветах с длиной оптического пути 1 см на приборе СФ-56 (ЛОМО, Россия) с системой интерфейса на базе персонального компьютера при ширине щели монохроматора 1 нм. Повторность единичных измерений пятикратная, с последующим усреднением результата. При построении калибровочных кривых использовали циклодекстрины (а-, в-, у-) квалификации х.ч., отечественного производства. В реакции использовали крахмал картофельный для нефелометрии. Концентрацию растворов ЦД рассчитывали по абсолютно сухому веществу (АСВ), определяя влажность имеющихся препаратов методом доведения до постоянного веса при 110°С. Калибровочные растворы готовили, смешивая 1 часть водного раствора ЦД соответствующей концентрации с 2 частями 3%-ного свежезаваренного крахмала в 0.1 М ацетате натрия, рН 5.70.
Приготовление фенолфталеинового реагента.
К 500 мл 0.1М раствора углекислого калия в дистиллированной воде при активном перемешивании добавляли ~3.5 мл 0.3%-ного фенолфталеина в 96% этиловом спирте. Полученный раствор доводили до значения D = 2.00 ± 0.15 при 553 нм в кювете 1 см путем точного подтитровывания тем же раствором фенолфталеина, а затем оставляли в плотно закрытом сосуде на 24 ч при комнатной температуре. По истечении указанного времени раствор разбавляли 0.1 М К2СО3 до Б553 = 1.00 ± ± 0.05 в 1-см кювете, помещали в темный пластиковый сосуд и хранили в холодильнике при 3-5°С, периодически проверяя экстинцию при 553 нм. Рабочим считали реагент, имевший величину ^553 > 0.850.
Перед проведением анализа необходимое для данной серии опытов количество фенолфталеинового реагента переливали в отдельный сосуд и доводили до комнатной температуры. Ферментативную реакцию осуществляли, используя в качестве субстрата растворимый картофельный крахмал с концентрацией 3% в 0.1 М ацетатном буфере (рН 5.70 ± 0.03), доведенным 10%-ной уксусной кислотой. Порцию 900 мкл субстрата помещали в пробирки Эппендорф и подогревали 5-10 мин в твердотельном термостате до 40°С. Реакцию инициировали введением в пробирку 450 мкл анализируемого ферментного раствора в 0.1 М ацетатном буфере (рН 5.70) при перемешивании. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 40°С, после чего отбирали 500 мкл продуктов реакции и с перемешиванием переносили в пластиковые пробирки на 5 мл, с предварительно отмеренной порцией (3000 мкл)
подогретого до комнатной температуры фенолфталеинового реагента, служившего одновременно стоп-раствором. Контролем являлись образцы реакционной смеси каждого из разведений фермента, не подвергшиеся инкубации в термостате. За единицу активности ЦГТазы принимали количество фермента, катализировавшего образование 1 мкМ Р-ЦД в течение 1 мин в описанных условиях. Активность Р-ЦГТазы рассчитывали по формуле:
E = [0.69058 ■ e(hD553/032721) - 0.68915]N/60, (1)
где E - активность тестируемого препарата куль-туральной жидкости, ед/мл; AD553 - разность оптических плотностей раствора фенолфталеина после внесения порций реакционной смеси и контрольного раствора; N - степень разбавления культуральной жидкости или ферментного препарата, использованного для определения активности, при котором разность оптических плотностей находится в рекомендуемом рабочем диапазоне 0.07 < D553 < 0.28.
Концентрацию образовавшегося Р-ЦД (в расчете на АСВ) в реакционной среде раствора крахмала в ацетатном буфере (рН 5.7) определяли по падению оптической плотности рабочего раствора согласно уравнению:
С(мг АСВ р-ЦД/л) = 232.25538 ■ e(AD553/032721) -- 231.8. (2)
Статистическая обработка. Обработку результатов измерений и аппроксимацию экспериментальных данных осуществляли с помощью программы Origin 7.0 Pro.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Принцип фенолфталеинового метода измерения активности ЦГТазы давно известен: при смешивании щелочного раствора фенолфталеина с исследуемой пробой, содержащей Р-ЦД, интенсивность малиново-пурпурной окраски снижается, изменение которой может быть измерено спектрофотометрически и, следовательно, сопоставлено с количеством внесенного макроцикли-ческого олигосахарида [5]. Метод выгодно отличается от ВЭЖХ аналога [7] высокой чувствительностью, быстротой и возможностью проведения измерений в больших сериях опытов. И в ранних [2], и более поздних [3-6] вариантах метода рекомендовано использовать свежий раствор Na2CO3, в который дозируется аликвота фенолфталеина в виде спиртового раствора. При этом, хотя и оговаривается, что рабочий раствор должен быть "приготовлен непосредственно перед определением",
d553, %
Рис. 1. Падение оптической плотности раствора фенолфталеина в натрий - (1-4) и калий - (5) карбонатном буфере различной ионной силы, (мМ): 1 - 5; 2 -10; 3 - 50; 4 - 100; 5 - 100.
не уточняется, должен ли укладываться временной интервал между смешиванием и измерением на спектрофотометре в секунды, минуты или же позволительны иные интервалы времени. Получить ответ на поставленный вопрос можно в простом эксперименте, смешав непосредственно в кювете натрий-карбонатный буфер с порцией спиртового фенолфталеина. На рис. 1 продемонстрирована кинетика падения экстинции моделей рабочих растворов фенолфталеина, приготовленных на основе карбоната натрия с различными концентрациями, лежащими в пределах, предложенных разными авторами [3-5, 7]. Из графика следует, что наиболее активное изменение малиново-пурпурной окраски фенолфталеина в растворе №2С03 происходит в течение первых 1.5 ч после добавления индикатора и относительная разница в оптической плотности стартового и экспонированных растворов может достигать 1520%. Очевидно, что подобные результаты нельзя назвать удовлетворительными, так как в основе метода лежит именно измерение разницы оптических величин контрольной и опытных смесей. Задержки при определении оптической плотности, изменение порядка замеров на спектрофотометре приводят к появлению эффекта "ложной" активности ЦГТазы или к получению парадоксального результата в виде "отрицательной циклизую-щей активности". Еще один источник ошибок лежит в самой методике приготовления малиново-пурпурного раствора, предписывающей дозирование фенолфталеина в этиловом спирте с помощью микродозаторов, не предназначенных для
летучих жидкостей. Сумма неудобств и недоработок приводит к тому, что от фенолфталеинового метода зачастую просто отказываются, а измерение активно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.