МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 3, с. 379-385
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.28;574.2
УСТОЙЧИВОСТЬ ДРОЖЖЕЙ РАЗНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП К ДЛИТЕЛЬНОМУ ХРАНЕНИЮ В ВЫСУШЕННОМ СОСТОЯНИИ © 2015 г. А. М. Глушакова*, А. В. Качалкин*, Т. М. Желтикова**, И. Ю. Чернов*, ***, 1
*Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения **НИИвакцин и сывороток имени И.И. Мечникова РАМН ***Институт проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова РАН Поступила в редакцию 25.07.2014 г.
Исследована устойчивость 14 видов дрожжевых грибов, принадлежащих к различным экологическим группам, к длительному сохранению жизнеспособности в высушенном состоянии. Результаты показали, что наименее устойчивыми оказались педобионтные дрожжи, выделяющиеся почти исключительно из почв гумидного климата и представленные такими видами, как Cryptococcus podzolicus, Cr. terricola, Lipomyces starkeyi. Неустойчивы к высушиванию также "нектарные" дрожжи, ассоциированные с нектаром энтомофильных растений (Metschnikowia reukaufii, Candida bombi). Эти виды полностью погибают в течение первого месяца хранения. Несколько более устойчивы эврибионтные виды, постоянно присутствующие в самых разнообразных местообитаниях: Cryptococcus magnus, Cr. victoriae, Debaryomyces hansenii, Cr. wieringae. Наиболее устойчивы к высушиванию представители пигментированных фитобионтных дрожжей, такие как Rhodotorula mucilaginosa и Sporobolomyces ro-seus, а также штаммы аскомицетовых дрожжей рода Candida, относящиеся к патогенным и условно-патогенным видам (Candida albicans, C. parapsilosis). Обнаружено, что особенности распространения дрожжей в природных местообитаниях тесно связаны с их способностью переносить длительные периоды высушивания.
Ключевые слова: дрожжи, устойчивость, высушивание, относительная влажность воздуха (ОВ), Candida albicans.
DOI: 10.7868/S0026365615030064
Проблема влияния активности воды и относительной влажности воздуха на развитие дрожжевых грибов включает самые различные аспекты. Доступность влаги является одним из важнейших факторов, лимитирующих их рост. Обычно она характеризуется таким параметром, как активность воды (aw). Низкий уровень aw определяется низким содержанием влаги, кристаллизацией воды, повышенной концентрацией осмотически активных веществ и характерен для целого ряда естественных и искусственных ценозов [1, 2]. Информация о значениях a„, при которых способны существовать разные виды дрожжей, актуальна и сильно востребована во многих областях, таких как хранение и транспортировка пищевых продуктов, охрана памятников культуры и предметов искусства, прогноз роста и распространения дрожжей в естественных условиях, в жилых помещениях, при разработке практических рекомендаций в отношении микроклимата жилых помещений, при планировании практических и эли-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: soilyeast@mail.ru).
минационных мероприятий, в практике биоконтроля [3].
При понижении a„ у мицелиальных и дрожжевых грибов увеличивается период прорастания спор, увеличивается период от начала прорастания до образования мицелия и спороношения, снижается скорость радиального роста колоний. Однако у разных дрожжевых и мицелиальных грибов чувствительность к пониженным значениям a„ различна [4—7]. Одна из стратегий ксеро-фильных и ксеротолерантных дрожжей — накопление осмотически активных веществ для защиты клеток. Дрожжи используют в качестве осмолита преимущественно глицерин [8, 9], либо потребляя его из субстрата, либо синтезируя de novo.
Активности воды принадлежит особая роль среди многих факторов, лимитирующих распространение дрожжей в природе. Большинство видов дрожжей перестает расти при a„ = 0.70—0.61. К такой активности воды, например, приближается 55—65% раствор глюкозы или 15—25% раствор NaCl [10]. Наиболее осмотолерантные дрож-
Исследованные штаммы дрожжей
Вид Штаммы
Candida albicans НИИВС 201, НИИВС 561
Candida bombi КБП 3935, КБП 3936, КБП 3937, КБП 4092
Candida parapsilosis НИИВС 705, НИИВС 967, НИИВС 1204
Cryptococcus magnus КБП 4129, КБП 4489, КБП 4490
Cryptococcus podzolicus КБП 6, КБП 4077, КБП 4198
Cryptococcus terricola КБП 3960, КБП 4051, КБП 4068
Cryptococcus victoriae КБП 3862, КБП 4014, КБП 4015, КБП 4273
Cryptococcus wieringae КБП 3928, КБП 3963
Debaryomyces hansenii КБП 4033, КБП 4058, КБП 4059
Lipomyces starkeyi КБП 105, КБП 2559
Metschnikowia reukaufii КБП 4036, КБП 4163
Rhodotorula mucilaginosa КБП 3859, КБП 4169, КБП 4170
Sporobolomyces roseus КБП 2555, КБП 4286
жи, способные расти в достаточно концентрированных сахаристых растворах, встречаются среди представителей родов Saccharomyces, Zygosaccha-romyces, Schizosaccharomyces. Многие штаммы эв-рибионтного вида Debaryomyces hansenii являются галотолерантными и часто встречаются в различных соленьях и консервированных мясных продуктах.
Вместе с этим, важнейшей характеристикой, определяющей успех в освоении дрожжами природных местообитаний, является способность к длительному сохранению в высушенном состоянии. Следует отметить, что методом посева дрожжи очень часто обнаруживаются в местообитани-
ях с постоянно низкой влажностью, таких как сухие травы, пыль, пустынные почвы. Более того, обычно максимальная численность эпифитных дрожжей характерна именно для сухих надземных частей растений, а не для активно вегетирующих. Например, на сухих частях растений и в растительном опаде в пустынях Кызылкум и Каракумы нами были обнаружены дрожжи, представленные в основном видом Cryptococcus albidus, в численности более 106 КОЕ/г [11].
Разные виды дрожжей по-разному устойчивы к длительному хранению в обезвоженном состоянии. Однако факторы, определяющие эту устойчивость, изучены довольно слабо. В качестве одного из них часто упоминают способность к образованию полисахаридных капсул [12, 13]. В частности, было показано, что капсульные формы широко распространенного вида дрожжей Cryptococcus albidus значительно более устойчивы к высушиванию, чем его бескапсульные варианты [14].
Исследования способности различных видов дрожжей переносить длительное высушивание весьма многочисленны, однако почти все они проводились в связи с проблемой хранения и поддержания лиофилизированных дрожжевых штаммов в коллекциях. В последнее время в связи с широким распространением в коллекциях методов криоконсервации интерес к этой тематике снизился. Экологические же аспекты устойчивости дрожжевых грибов к длительному высушиванию практически не изучались.
Цель настоящей работы — сравнение устойчивости различных видов дрожжей к длительному высушиванию в связи с их экологическими особенностями, приуроченностью к тем или иным типам природных местообитаний.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучали способность дрожжевых грибов к развитию после длительного пребывания в условиях голодания и низкой относительной влажности воздуха. В качестве объектов исследования были выбраны виды дрожжей, регулярно выделяющиеся из природных растительных и почвенных субстратов в средней полосе России, особенности распространения которых хорошо известны и многократно подтверждены статистически на основе многолетних наблюдений [15]. Исследованные штаммы дрожжей были выделены нами из различных природных субстратов в 2010—2012 гг. и идентифицированы на основании анализа нук-леотидных последовательностей D1/D2 региона 26S (LSU) рДНК. Все штаммы хранятся в коллекции дрожжей кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ (КБП), штаммы факультативно-патогенных видов Candida albicans и
C. parapsilosis — в коллекции Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (НИИВС). Каждый вид был представлен 2—4 штаммами. Всего было изучено 35 штаммов, относящихся к 13 видам (таблица). Виды были подобраны так, чтобы они представляли различные жизненные формы, ассоциированные с различными типами местообитаний. Среди них представлены типичные педо-бионты (Lipomyces starkeyi, Cryptococcus terricola, Cr. podzolicus), практически все известные выделения которых сделаны из различных горизонтов почв. Эврибионтные виды, обнаруживающиеся с более или менее равной вероятностью в самых различных природных местообитаниях (Cr. magnus, Cr. victoriae, Cr. wieringae, Debaryomyces hanse-nii). Типичные фитобионты, в основном ассоциированные с различными надземными частями растений (Rhodotorula mucilaginosa, Sporobolomyces roseus). "Нектарные" дрожжи, постоянно присутствующие в цветочном нектаре энтомофильных растений (Metschnikowia reukaufii, Candida bombi). А также факультативно-патогенные виды, встречающиеся в различных природных субстратах, но в основном относящиеся к компонентам нормальной микрофлоры человека и способные вызывать кандидозы (C. albicans, C. parapsilosis). Все исследованные штаммы не образовывали каких-либо покоящихся структур (аскоспоры, хламидо-споры, телиоспоры), совершенные виды были представлены анаморфами.
Штаммы выращивали на глюкозо-пептонной среде в течение 7 сут при температуре 25°C. Мик-роскопирование показало, что клетки всех штаммов обильно почковались, то есть находились в фазе активного роста. Из каждого штамма готовили клеточную суспензию в воде. По 100 мкл суспензии помещали на стерильную фильтровальную бумагу размером 1 см2. Для каждого штамма готовили по 20 бумажных фильтров. Фильтры высушивали в ламинарном шкафу и помещали в стерильные чашки Петри по 5 фильтров на чашку. Чашки Петри держали в стерильных боксах при температуре 25°C в течение 90 сут. Относительную влажность воздуха и температуру контролировали с помощью термометра ТК-5.06 с функцией измерения относительной влажности. Относительная влажность воздуха в боксах на протяжении всего исследованния, начиная с 30-х суток, была ниже 40%.
Через 30, 60 и 90 сут хранения из чашек Петри отбирали находящиеся там высохшие фильтры, помещали их в стерильные эппендорфы с 1 мл стерильной воды и обрабатывали на вортексе (MultiReax, Heidolph, Germany) в течение 60—75 мин так, чтобы фильтровальная бумага потеряла целостность. По 100 мкл полученной суспензии высевали на глюкозо-пептонную среду в 5-ти по-в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.