ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 5, с. 345 - 348
УДК 541.128.1+577.15.02
УСТОЙЧИВОСТЬ ФЕНИЛГИДРАЗИДНОЙ ЗАЩИТНОЙ ГРУППЫ, БЛОКИРУЮЩЕЙ БОКОВЫЕ КАРБОКСИЛЬНЫЕ ФУНКЦИИ АСПАРАГИНОВОЙ И ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТ, В УСЛОВИЯХ ТВЕРДОФАЗНОГО СИНТЕЗА ПЕПТИДОВ
© 1995 г. А. Н. Семенов
Совместное российско-германское предприятие "Константа", 123056, Москва, Грузинский пер., 3/2
Поступила в редакцию 09.06.94 г.
Изучена стабильность фенилгидразидной защитной группы, блокирующей боковые карбоксильные функции аспарагиновой и глутаминовой кислот, б условиях, имитирующих реакционную среду отдельных стадий твердофазного синтеза пептидов. Показана устойчивость фенилгндразидной группы в условиях удаления Вое- и Ртос-защитных групп и при ацилировании избытками активированных эфирои (пентафторфениловых и гидроксибензотриазоловых), но нестабильность в реакциях с ангидридами в присутствии оснований.
Ключевые слова: фенилгидразидная защитная группа, твердофазный синтез пептидов.
Фенилгидразидная защитная группа, блокирующая карбоксильную функцию, известна еще с 50-х годов. Тем не менее эта защита не получила широкого распространения в практике пептидного синтеза из-за жестких окислительных условий ее снятия:
-СО-Ш-Ш-С6Н, -СО-К'=Ы-СйН5 -----СООН + + С6Н6.
В предыдущих работах [1,2] мы показали, что для мягкого удаления фенилгидразидной защитной группы в окислительных условиях можно использовать в качестве катализаторов ферменты класса оксидоредуктаз - пероксидазу или лакказу (в случае водорастворимых пептидов) [1, 2] или комплексы меди с азотсодержащими лигандами, имитирующими активный центр лакказы (в случае водонерастворимых пептидов) [3, 4]. Каталитическое деблокирование протекает в мягких условиях, исключающих удаление других защитных групп или окисление лабильных аминокислот (метионин, триптофан, тирозин, гистидин). Предложенный способ мягкого каталитического удаления фенилгидразидной защитной группы позволил реализовать новую схему синтеза ключевого фрагмента (1 - 16) кальцитонина лосося [5, 6]; также завершается разработка простой схемы синтеза [Ьу88]вазопрессина. Можно с уверенностью сказать, что фенилгидразидная защитная группа имеет безусловные перспективы для использования в практике рутинного синтеза пептидов в растворе.
Используемые сокращения: НОВ! - М-гидроксибензотри-азо.п, Итос - флуоренилметилоксикарбонил, РГр - пента-фторфенил, 01р - пироглутаминовая кислота.
Насколько нам известно, до настоящего времени не описаны попытки использовать фенилги-дразидную защитную группу для твердофазного синтеза пептидов, В то же время следует признать, что проблема эффективной защиты боковых карбоксильных функций аспарагиновой и/или глутаминовой кислот еще далека от разрешения. В каталогах ведущих фирм-производителей реактивов для твердофазного синтеза пептидов представлены три вида производных аспарагиновой и глутаминовой кислот по ш-карбоксильным функциям - треш-бутиловые, бензиловые и цикло-гекспловые эфиры. Для их деблокирования используются кислотные условия разной степени жесткости. В то же время в твердофазном синтезе большое распространение находят кислотола-бильные и г и п ер ки сл ото л а б ильные якорные группы [7]. Очевидно, что в комбинации таких якорных групп с коммерчески доступными защищенными аминокислотами невозможно удалить боковую защитную группу а спара гино вой / г л у та ми новой кислоты без снятия пептида со смолы. А селективное деблокирование Акр/С1и может быть необходимо для синтеза К-гликопсптидов (8] или иной модификации боковой карбоксильной группы аспара-гиновой/глутаминовой кислот в процессе твердофазного синтеза. В связи с этим представляется перспективным использование фенилгидразидной группы для защиты боковых карбоксильных функций аспарагиновой и глутаминовой кислот при синтезе пептидов.
Цель настоящей рабо ты - изучение устойчивости фенилгидразидной защитной группы в условиях, имитирующих реакционную среду стадий
346
СЕМЕНОВ
твердофазного синтеза пептидов. Под стадиями твердофазного синтеза пептидов будем понимать следующее: деблокирование а-аминогруппы три-фторуксусной кислотой (25% раствор в хлороформе или хлористом метилене в течение 30 мин) с последующей нейтрализацией триэтиламином (10% раствор в хлороформе в течение 3 мин) для Вос-версии временной защиты а-аминогрупп или пиперидином (20% раствор в П)\1Р в течение 10 мин) для Ртос-версии временной защиты а-аминогруппы; конденсация с избытком ацилирующего агента в одной из трех наиболее популярных в настоящее время модификаций (симметричные ангидриды в присутствии диизопропилэтиламина, пентафторфениловые эфиры и эфиры Ы-гидро-ксибензотриазола); ацилирование непрореагиро-вавших аминогрупп уксусным ангидридом в присутствии триэтиламина.
По-определению фенилгидразидная защитная группа, блокирующая боковые карбоксильные функции глутаминовой и аспарагиновой кислот, должна быть удалена до отщепления пептида со смолы. Поэтому устойчивость этой защитной группы в условиях тотального деблокирования и/или отщепления пептидов со смолы не изучалась.
В литературе давно описана побочная реакция, характерная для 1Ч-концевого глутамина, -его циклизация в остаток пироглутаминовой кислоты [9]. Производные глутаминовой кислоты, боковые карбоксильные функции которых защищены фенилгидразидной группой, химически в известной степени подобны глутамину. Поэтому в данной работе исследовалась также устойчивость защищенной Ы-концевой глутаминовой кислоты в условиях катализируемого слабыми кислотами процесса циклизации.
В качестве модельных соединений использовали простейшие производные аспарагиновой и глутаминовой кислот - 7-А.чр^НННС6Н,)-1ЯНСН3 и
г<Ии(ШШС6Н5)-ШСН3. Результаты исследования устойчивости этих прбизводных в условиях, имитирующих условия твердофазного синтеза пептидов, представлены в таблице.
Деблокирование в кислой среде. Как видно из таблицы, фенилгидразидная защитная группа полностью ус тойчива в условиях удаления Вос-группы (опыт 1). При продолжительности (согласно стандартному протоколу) одного цикла деблокирования 30 мин [10] устойчивость фенилгидразидной защиты достаточна для проведения по крайней мере 48 циклов.
Нейтрализация триэтиламином. В присутствии триэтиламина не наблюдается характерной для бензильной защитной группы (описанной на примере Вос-А5р(ОВг1)-Х [11]) реакции циклизации (опыт 4).
Деблокирование пиперидином. Фенилгидразидная группа устойчива в условиях удаления Ртос-группы в течение 6 ч (см. рис. 1, /), что достаточно для проведения 36 циклов [10]. Тем не менее при длительной инкубации в 20% пиперидине фенилгидразидная группа не вполне устойчива (рис. 1,1; таблица, опыт 2). Предварительные исследования (не приводятся) позволили сделать предположение, что нестабильность фенилгидразидной группы в присутствии пиперидина связана с ее окислением кислородом воздуха в щелочной среде. В связи с этим было изучено влияние восстановителей на устойчивость фенилгидразидной группы в среде, содержащей 20% пиперидина. Данные таблицы (опыт 3) и рис. 1 указывают на то, что в присутствии восстановителей устойчивость фенилгидразидной группы возрастает. Так, в присутствии 5% меркаптоэтанола защитная группа сохраняется в течение 24 ч (144 цикла) [10] (рис. 2), т.е. она более устойчива, чем бензильная защита [12].
Устойчивость г^р(ЫНЫНС6Н5)-ЫНСН3 (1) и г-01и(КНЬ1НС6Н5)-ЫНСН3 (2) в условиях, имитирующих стадии твердофазного синтеза пептидов*
Номер опыта Условия обработки (24 ч) Устойчивость, %
(1) (2)
1 25% ТРА в хлороформе 100 100
2 20% пиперидина в ЭМР 47 74
3 20% пиперидина +1% меркаптоэтанола в ОМР 70 100
4 10% ТЕА в хлороформе ** 100 100
5 2-С31у/НОВ[ (25 : 1)/диизопропилкарбодиимид 100 100
6 Вос-А1а-ОР1"р (10:1) 100 100
7 Ас20 (10 : 1) в присутствии Рг^!^ 65.7 90.4
8 Ас20 (10 : 1) в присутствии 63.2 75.3
* Соотношение реагентов взяты согласно рекомендациям стандартного протокола [10]; в скобках приведен избыток
ацилирующего реагента. ** Время обработки 3 ч.
УСТОЙЧИВОСТЬ ФЕНИЛГИДРАЗИДНОЙ ЗАЩИТНОЙ ГРУППЫ
347
Кроме того, следует указать, что конструкция практически всех современных автоматических синтезаторов пептидов предполагает проведение реакций в инертной атмосфере (в отсутствие кислорода). Следовательно, можно сделать вывод о совместимости фенил гидразидной группы и Ртос-защиты.
Ацилированис избытком ацилирующего агента. При проведении твердофазного синтеза пептидов для получения высокого выхода на каждой стадии практикуется использование избытка высокореакционных ацилирующих агентов и/или их повторное использование (так называемый ге-еоир1тд) [10]; для блокирования непрореаги-ровавших аминогрупп используют высокореакционную систему уксусный ангидрид - триэтил-амин [10]. В литературе имеются сведения, что атомы азота фенилгидразидной группы в достаточно жестких условиях могут быть проацилиро-ваны [13]. В связи с этим была изучена устойчивость фенилгидразидной группы по отношению к различным ацилирующим агентам, используемым в стандартных протоколах твердофазного синтеза пептидов. Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что фенилгид-разидная группа не взаимодействует с пентафтор-фениловыми (опыт 6) и гидроксибензотриазоло-выми (опыт 5) эфирами аминокислот. В то же время уксусный ангидрид в присутствии оснований взаимодействует с фенилгидразидной группой, при этом более устойчиво производное глу-таминовой кислоты (опыты 7 и 8).
Следовательно, при использовании фенилгидразидной группы для защиты боковых функций аспарагиновой и глутаминовой кислот нужно избегать применения ангидридов как на стадии синтеза пептидной связи, так и для блокирования не-прореагировавших аминогрупп.
Образование пироглутамнновой кислоты. Известно, что 1Ч-концевой остаток глутамина в присутствии слабых кислот (например, В ос-аминокислот) претерпевает циклизацию с образованием остатка пироглутамнновой кислоты [9]. Это приводит к обрыву цепи и образованию "неправильной" последовательности при синтезе:
н2ы-со-сн2-сн:
I
ЬШ-СН-СО-Р
К-СООН
К-СООН 9° СН2 сн2
1-Ш-СН-СО-Р
Р - полимер
Аналогичный процесс может происход
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.