ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 417, № 4, с. 557-559
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 547.995.15
УСТОЙЧИВОСТЬ IN VITRO ОКИСЛЕННОЙ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ К ТЕСТИКУЛЯРНОЙ ГИАЛУРОНИДАЗЕ
© 2007 г. И. Ю. Понеделькина, В. Н. Одиноков, Э. А. Саитгалина, член-корреспондент РАН У. М. Джемилев
Поступило 04.07.2007 г.
Окисленная по гидроксиметильной группе ги-алуроновая кислота проявляет повышенную фер-ментоустойчивость in vitro к действию тестику-лярной гиалуронидазы.
Гиалуроновая кислота относится к классу кислых гликозаминогликанов - гетерополисахаридов линейного строения, является основным веществом внеклеточного матрикса, выполняет важные функции в организме и состоит из повторяющихся звеньев .D-глюкуроновой кислоты и N-аце-тил-В-глюкозамина. В последние годы возрастает интерес к обладающим пониженной ферментативной биодеградируемостью производным гиалуро-новой кислоты, перспективным для применения в
В спектре 13С ЯМР кислоты II обнаруживаются три сигнала карбонильных групп с 5 177.5, 177.2 и 176.4 м.д., свидетельствующие об образовании дополнительно к имеющимся карбоксильной и ацетамидной группам новой СООН-группы вследствие окисления гидроксиметильной группы исходной кислоты I. Отсутствие характерного для кислоты I сигнала гидроксиметильной группы с 5 63.1 м.д. доказывает ее исчерпывающее окисление. Таким образом, в состав полученной карбокси-гиалуроновой кислоты II входят звенья В-глюкуроновой и ^ацетилглюкозаминуроно-вой кислот. Следует отметить, что ^ацетил-В-глюкозаминуроновая кислота является структур-
Институт нефтехимии и катализа Российской Академии наук, Уфа
качестве лекарственных средств пролонгированного действия [1-3].
Нами обнаружено, что окисление гидроксиме-тильных групп в карбоксильные придает гиалу-роновой кислоте устойчивость in vitro к воздействию тестикулярной гиалуронидазы.
Гиалуроновая кислота (I) извлечена щелочной экстракцией из пупочных канатиков новорожденных и очищена анионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе, как описано в работе [4]. Действием на кислоту I гипохлорита натрия в присутствии бромида натрия и каталитического количества 2,2,6,6-тетраметилпиперидиний-1-ок-сила (ТЕМПО) в воде [5] получена модифицированная гиалуроновая кислота II:
ным элементом внеклеточного полисахарида, генерируемого дрожжеподобным черным грибком Rhinocladiella ташопи NRRL Y-6272 [6, 7].
Нами обнаружено, что содержание звеньев В-глюкуроновой кислоты, найденное карбазоловым методом, основанным на реакции Дише [8], в кислотах I и II практически одинаково и составляет 49.5 и 50.9 мольн. % соответственно. Это свидетельствует, что данный метод не чувствителен на присутствие звеньев ^ацетилглюкозаминуроно-вой кислоты. На основе данного наблюдения предложен спектрофотометрический метод определения степени ферментативной биодеградации карбокси-гиалуроновой кислоты II относительно нативной гиалуроновой кислоты I. Сущность метода заключается в определении относительного поглощения хромофоров (к 530 нм), которые образуются в реакции Дише из В-глюкуроновой
NaOCl, NaBr, H2O, pH 10.2
>Ck
N t
O
558
ПОНЕДЕЛЬКИНА и др.
Отн. биодеградируемость, %
30 г
25 20 15 10 5
0
30
60
120 у.е./мл
Рис. 1. Зависимость биодеградируемости in vitro карбокси-гиалуроновой кислоты II от концентрации гиалуронидазы.
кислоты, содержащейся в продуктах ферментативного расщепления кислот I и II.
При концентрации фермента 3 у.е./мл, близкой к концентрации в сыворотке крови человека [9], кислота II практически не деградирует по сравнению с интактной гиалуроновой кислотой I (рис. 1). Биодеградируемость кислоты II постепенно возрастает с увеличением концентрации фермента. Однако даже при концентрации гиалуронидазы 120 у.е./мл относительная биодеградируемость кислоты II не превышает 26% (рис. 1).
Таким образом, установлено, что окисление по первичным гидроксигруппам приводит к существенному увеличению устойчивости гиалуроновой кислоты к действию in vitro фермента тести-кулярной гиалуронидазы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Спектры 13С-ЯМР регистрировали для растворов в D2O на спектрометре Bruker AMX-300, в качестве внутреннего стандарта использовали натриевую соль 3-(триметилсилил)-1-пропансульфоновой кислоты. УФ-спектры получали на спектрофотометре Specord M-40. Контроль рН растворов проводили с помощью рН-метра "рН-340". В работе применялась тестикулярная гиалуронидаза без дополнительной очистки (ЕС 3.2.1.35, фармакопейный препарат Лидаза). Гипохлорит натрия (13%-ный водный раствор) поставлен фирмой "Aldrich".
Окисление гиалуроновой кислот ы I. Растворяли в 40 мл воды 200 мг (0.5 ммоль) гиалуроновой кислоты I, 10.3 мг (0.1 ммоль) NaBr и 0.84 мг (0.0054 ммоль) ТЕМПО, охлаждали до 0 ± 2°С и при интенсивном перемешивании вноси-
ли 0.8 мл 13%-ного гипохлорита натрия. Сразу после этого к реакционной смеси добавляли 1 N HCl до рН 10.2, и поддерживали это значение с помощью 0.2 N NaOH до завершения реакции (1 ч). Затем приливали 120 мл метанола, осадок центрифугировали, промывали последовательно метанолом (40 мл), диэтиловым эфиром (40 мл) и выдерживали 2 ч при пониженном давлении и температуре не выше 60°С, получив 190 мг (87%) кислоты (II). Спектр ЯМР 13C (D2O, 5, м.д.): 177.5, 177.2, 176.4, 105.3, 102.8, 83.7, 82.8, 78.7, 78.2, 75.9, 74.7, 69.9, 56.6, 24.9.
Ферментативное расщепление
окисленной гиалуроновой кислоты II. В каждую из 4 центрифужных пробирок (V = 10 мл) помещали 4.37 мг (0.01 ммоль) кислоты II и 0.9 мл цитратного буфера (30 мМ лимонная кислота/150 мМ Na2HP04/150 мМ NaCl, pH 6.3), добавляли раствор гиалуронидазы (3, 30, 60 или 120 у.е.) в 0.1 мл цитратного буфера и инкубировали при 37°C в течение 20 ч. Затем в каждую пробирку добавляли 4 мл смеси (3:1) MeOH/Et2O, выдерживали 1 ч при 0°C, осадок отделяли центрифугированием. Соответствующий супернатант помещали в стеклянный стакан и упаривали, твердый остаток растворяли в точно измеренном объеме воды (от 5 до 10 мл), получив раствор низкомолекулярных продуктов ферментативной деградации. Затем каждый раствор анализировали на содержание D-глюкуроновой кислоты по реакции Дише: в пробирку с аликвотой (0.5 мл) из каждого раствора добавляли 3 мл конц. H2SO4, выдерживали 20 мин на кипящей водяной бане, охлаждали до комнатной температуры, приливали 0.1 мл 0.1%-ного спиртового раствора карбазола. Пробирку интенсивно встряхивали, нагревали 1-2 мин на кипящей водяной бане, охлаждали и измеряли поглощение (к = 530 нм) каждого из окрашенных в розово-фиолетовый цвет растворов относительно раствора сравнения (ср. [10]).
Ферментативную обработку гиалуроновой кислоты I и реакцию Дише для продуктов деградации проводили аналогично. Из отношения (%) поглощения подготовленных по реакции Дише растворов определяли биодеградируемость кислоты II относительно кислоты I при каждой концентрации гиалуронидазы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Vercruysse K.P., Marecak D.M., Marecak J.F., Prestwich G.D. // Bioconj. Chem. 1997. V. 8. № 5. P. 686-694.
2. Prestwich G.D, Marecak D.M., Marecak J.F. et al. // J. Controll. Rel. 1998. V. 53. P. 99.
3
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 417 < 4 2007
УСТОЙЧИВОСТЬ IN VITRO ОКИСЛЕННОЙ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ
559
3. Hirano K, Sakai S, Ishikawa T. et al. // Carbohydr. Res. 2005. V. 430. № 14. P. 2297-2304.
4. Понеделъкина И.Ю., Одинокое ВН., Вахруше-ва Е.С. и др. // Биоорган. химия. 2005. Т. 31. № 1. С. 90-95.
5. Jiang B, Drouet E, Milas M, Rinaudo M. // Carbohydr. Res. 2000. V. 327. P. 455-461.
6. Sanford P.A., Burton K.A., Watson PR. et al. // Appl. Microbiol. 1975. V. 29. № 26. P. 769-775.
7. Burton K.A., Cadmus M.C., Lagoda A.A. et al. // Bio-technol. Bioeng. 1976. V. 18. № 12. P. 1669-1677.
8. Dische Z. // J. Biol. Chem. 1947. V. 167. P. 189-198.
9. DelpechB, BertrandP., Chauzy C. // J. Immunol. Meth. 1987. V. 104. P. 223-229.
10. Методы химии углеводов / Под ред. Н.А. Кочетко-ва. М.: Мир, 1967.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 417 < 4 2007
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.