ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 416, № 1, с. 123-125
^=МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 632.9:579.842.24 + 581.2
УСТОЙЧИВОСТЬ К ERWINIA CAROTOVORA РАСТЕНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С МОДИФИЦИРОВАННЫМИ БАКТЕРИЯМИ,
УТРАТИВШИМИ ПАТОГЕННОСТЬ
© 2007 г. С. В. Чернышев, Ю. П. Ермакова, Н. С. Захарченко, Е. Б. Георгиевская, Я. И. Бурьянов
Представлено академиком А.И. Мирошниковым 21.02.2007 г. Поступило 21.02.2007 г.
Проблема взаимодействия микроорганизмов и растений в последнее время привлекает все большее внимание исследователей в различных областях биологических наук. Растения в природе постоянно контактируют с множеством микроорганизмов, которые могут либо вызывать различные заболевания, либо приносить растениям определенные преимущества. Возможность контроля этих процессов является значимой как с точки зрения повышения продуктивности сельскохозяйственных растений, так и в целях борьбы с различными эпифитотиями в природе.
Способность к формированию различного типа ассоциаций с растениями присуща широкому спектру микроорганизмов. Многие эпифитные бактерии ассоциированы с поверхностью листьев или корней и зависят от выделяемых растением органических веществ. Эктосимбионты ведут себя подобно эпифитам, но также обеспечивают растениям, на которых существуют, определенные преимущества от этого симбиоза. Это может быть и фиксация азота [1], и синтез витаминов и фитогормонов [2, 3]. Однако детальных исследований микроорганизмов, переходящих от паразитического образа жизни к симбиотическому, и последствий такого перехода для растений до настоящего времени не проводилось.
Целью данной работы явилось изучение взаимодействия бактерий Етша carotovora subsp. carotovora (Е.с.с.), утративших патогенность, с растениями табака и картофеля и влияние микроорганизмов-колонизаторов на устойчивость растений к воздействию фитопатогена. Для этого в работе использовали штамм Е.с.с. S14-13, полученный нами ранее и содержащий плазмиду рАМ28, супрессирующую патогенность данной бактерии [4, 5].
Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии наук, Пущино Московской обл.
Колонизировали эрвиниями S14-13 как изолированные листья табака и картофеля, так и целые растения. Для колонизации листьев использовали молодые верхушечные листья, отделенные от растений, выращенных in vitro на агаризованной питательной среде MS [6]. Листья обрабатывали суспензией бактериальных клеток, которые выращивали на богатой питательной среде LB при температуре 28°С до оптической плотности культуры 0.1 ОЕ при длине волны 580 нм (титр 5 ■ 108 клеток/мл). После обработки их помещали в чашки Петри с агаризованной средой MS и культивировали в течение 10 дней. Установлено, что листья, обработанные бактериями, не претерпели за это время каких-либо изменений по сравнению с контролем. Аналогичным образом колонизировали и растения, обрабатывая бактериальной культурой черенки, полученные из апикальных частей с последующей высадкой их в стеклянные сосуды с питательной средой. Через 4 недели после укоренения и роста растений определяли наличие жизнеспособных бактерий, ассоциированных с верхушечными листьями при их гомогенизации в микропробирке и посеве гомогената на агаризованную среду LB. Показано, что возникала устойчивая ассоциация между бактериями и растениями, сохранявшаяся на протяжении всего их жизненного цикла и передававшаяся в ряду поколений при вегетативном размножении растений путем черенкования их апикальной части, поскольку микроорганизмы высевались с растений, претерпевших ряд раундов пассирования в течение года. Количество КОЕ составляло 7 ■ 102-103 клеток/см2. То, что при этом не происходило повреждения и деградации растительной ткани, свидетельствует об изменении статуса эрвиний и переходе их от паразитического образа жизни к симбиотическому.
В следующей серии экспериментов определяли устойчивость колонизированных листьев и целых растений к заражению патогенным штаммом E.c.c. В15. При работе с изолированными листья-
Опыт
ЧЕРНЫШОВ и др. Контроль Контроль
Опыт
V -
■ v Л J
j j
Рис. 1. Влияние колонизации на устойчивость к патогену изолированных листьев табака (а), картофеля (б). В левой части - колонизированные листья, в правой -контрольные.
ми перед инфицированием предварительно выдерживали их на агаризованной среде в течение трех суток для формирования устойчивой ассоциации с бактериями-колонизаторами. Обработку патогеном производили, погружая листья в суспензию клеток, затем культивировали их на свежей среде MS. Уже через сутки на контрольных листьях заметно разрушение ткани мезофилла. Причем процесс деградации был ассоциирован с сосудистой системой листа, поскольку первоначально распространение инфекции происходило вдоль крупных, а затем и мелких жилок. К концу вторых суток поражение контрольных листьев составляло 100% по площади. В то же время колонизированные листья оставались без феноти-пических изменений (рис. 1). В эксперименте на целых растениях было установлено, что этот эффект также сохранялся. Предварительно апикальные части взрослых растений табака и картофеля подвергали бактериальной колонизации E. carotovora S14—13 и культивировали in vitro на агаризованной питательной среде в течение 4 недель. Затем выросшие растения инфицировали клетками патогенного штамма эрвиний В15. Заражение проводили, нанося бактериальную суспензию на срез черешка листа, а также делая укол листовой поверхности иглой, смоченной сус-
Рис. 2. Влияние колонизации на устойчивость к патогену целых растений: табака (а), картофеля (б). В левой части - контрольные растения, в правой - колонизированные.
пензией бактерий. Инфицирование контрольных неколонизированных растений проводили аналогичным способом. Уже через сутки на контрольных растениях было заметно распространение инфекции вниз и вверх по стеблю. У табака на месте точечного укола на листе образовалась зона мацерации мезофилла, со временем увеличивающаяся по площади. Причем происходило это так же, как и в предыдущих экспериментах на изолированных листьях, преимущественно по сосудистой системе. На колонизированных растениях картина выглядела иначе. Инфицированный черешок подсыхал, и дальнейшего распространения инфекции на стебель не происходило. На листе вокруг точки укола также образовалось небольшое пятно некротического усыхания диаметром 5-7 мм, далее не увеличивающееся в размерах. На третьи сутки контрольные растения были поражены более чем наполовину, стебель побурел и надломился, а колонизированные оставались без дальнейших признаков поражения вплоть до окончания вегетации, вызванной естественным процессом старения организма (рис. 2).
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 416 < 1 2007
УСТОЙЧИВОСТЬ К ERWINIA CAROTOVORA РАСТЕНИЙ
125
Таким образом, результаты проведенных экспериментов указывают на тесную симбиотиче-скую связь растений с бактериями, утратившими вирулентность и одновременно приобретающими способность защищать хозяина от воздействия фитопатогена. Образование эрвиниями ассоциации с растениями представляется вполне закономерным явлением, поскольку эти микроорганизмы в силу особенностей своей биологии приспособлены к взаимодействию с растительным организмом и имеют для этого все необходимые механизмы. Кроме того, эрвинии, будучи почвенными микроорганизмами, обладают чрезвычайно лабильным метаболизмом, позволяющим им достаточно легко и без ущерба для себя переходить от сапрофитного образа жизни к паразитическому и наоборот [7].
Продемонстрированный в наших экспериментах защитный эффект, возникающий при колонизации растений эрвиниями, напрямую связан с индукцией системной приобретенной устойчивости, возникающей у растений в ответ на первичную атаку непатогенов, патогенов или продуктов метаболизма паразита и хозяина, а также с конкурентными взаимоотношениями между различными популяциями микроорганизмов одного вида. Известно, что бактерии обладают специфическими механизмами мониторинга конкурентов и растительных хозяев и выработали на подобные контакты системы адекватного ответа, включающие синтез специфических сигнальных молекул - производных гомосеринлактона (АГСЛ) [8]. Бактерии используют эти молекулы прежде всего для того,
чтобы следить за плотностью своей популяции через регуляцию генов, обеспечивающих процесс деления клеток, а также генов, связанных с патоген-ностью [9]. В наших экспериментах микроорганизмы-колонизаторы, используя те же сигналы межклеточной коммуникации, что и патоген, и уже занимая ту же экологическую нишу, препятствуют его размножению и распространению.
Авторы выражают благодарность академику А.И. Мирошникову за ценные советы и замечания при подготовке рукописи.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kleeberger A., Klingmuller W. // Mol. and Gen. Genet. 1980. V. 180. P. 621-627.
2. Иванова Е.Г., Доронина H.B, Троценко Ю.Л. // Микробиология. 2001. T. 70. № 4. C. 452-458.
3. Holland MA. // Plant Physiol. 1997. V. 115. № 3. P. 865-868.
4. Мельников Л.Л., Бенц П., Чернышов C.B, Ша-лаи Л. // Генетика. 1996. T. 32. № 9. C. 1167-1171.
5. Чернышов C.B, Мельников Л.Л., Бурьянов ЯИ. // Молекуляр. биология. 1999. T. 33. № 2. C. 197-202.
6. Murashige T., Skoog F. // Physiol. Plantarum. 1962. V. 15. P. 473-497.
7. BellK. S, Sebaihia M, PritchardL. et al. // Pra. Nat. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 11105-11110.
8. von Bodman S.F., Bauer W.D., Coplin D.L. // Annu. Rev. Phytopathol. 2003. V. 44. P. 455-482.
9. WhiteheadN.A., Byers J.T., Commander P. et al. // Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol. and Serol. 2002. V. 81. P. 223-231.
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 416 < 1 2007
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.