БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, М 8, с. 571 - 579
УДК 577.322.5;543.422.25
УТОЧНЕНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ НЕЙРОТОКСИНА II ИЗ ЯДА Naja naja oxiana
© 1995 г. А. П. Голованов, А. С. Арсеньев*
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАИ, 117871, ГСП-7, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 02.11.94 г.
Путем минимизации (информационной энергии с ограничениями, полученными из экспериментальных данных 'Н-ЯМР, рассчитан набор из 19 пространственных моделей нейротоксина II Naja naja oxiana. Среднее попарное среднеквадратичное отклонение положений атомов и полученном наборе структур составило 0.86 Ä для тяжелых атомов основной цепи и 1.48 Á для всех тяжелых атомов. Для объяснения относительно медленных скоростей дейтерообмена амидных протонов Val45 и Leu51, экспонированных согласно рассчитанным структурам в растворитель, предложена модель димера нейротоксина П. Полученные модели как мономерной, так и димерной формы нейротоксина II в дальнейшем могут быть использованы для детального изучения его функциональных, гидрофобных и электростатических свойств-
Ключевые слова: нейротоксин, пространственная структура, ЯМР, конформационная энергия.
Анализ известных трехмерных структур белков необходим для детального понимания основ пространственной укладки и функционирования белковых молекул. Очень удобными объектами для такого анализа являются постсинаптические нейротоксины (см., например, обзоры [1, 2]). Эти нейротоксины блокируют синаптическую передачу сигнала путем специфичного связывания с никотиновым ацетилхолиновым рецептором. Нейротоксины, выделенные из ядов змей, образуют семействе белков, обладающих сходной структурой. Существуют два класса нейротоксинрв. Короткие нейротоксины состоят из 60 - 62 аминокислотных остатков и содержат 4 дисульфидные связи. Длинные нейротоксины состоят из 70 - 74 остатков и со держат 5 дисульфидных связей. В настоящее время известно более 100 аминокислотных последовательностей нейротоксинов длинного и короткого типа, множество работ посвящено изучению механизмов их функционирования (см. обзоры [3 - 5]).
Детальное пространственное строение известно для нескольких нейротоксинов длинного и короткого типа. Хотя общая укладка полипептидной цепи всех нейротоксинов очень схожа, даже небольшие отличия в кон формации и/или конфор-мащюнной подвижности между нейротоксинами могут объяснить заметные различия в кинетике связывания с рецептором и в токсичности [6]. Про-странстленные структуры, полученные методом
-J-!—
Сокращения: N111 - нейротоксин II; СКО - среднеквадратичное отклонение. * Автор 1у1я переписки.
рентгеноструктурного анализа, опубликованы для нейротоксинов короткого типа (эрабутокси-нов а и b [7 - 11 ]) и длинного типа (а-кобротокси-на [12, 13] и а-бунгаротоксина [14]). По данным спектроскопии ЯМР, в растворе были получены пространственные структуры а-бунгаротоксина [15, 16] и а-кобротоксина [17], а также коротких токсинов: а-нейротоксина Dendroaspis polylepis polylepis [18, 19], токсина a Naja nigricollis [20] и кобротоксина [21, 22]. В нашей предыдущей работе [23 J методом дистанционного геометрического алгоритма на основании данных спектроскопии 'Н-ЯМР рассчитана пространственная структура короткого нейротоксина TI (NtH) Naja naja oxiana. Полученная структура хорошо согласовывалась с интенсивностями ядерного эффекта Оверхау-зера, с величинами вицинальных констант спин-спинового взаимодействия протонов NH-CaH и С"Н-СрН, а также с наблюдаемыми скоростями обмена протонов амидных групп NH на дейтерий растворителя. Однако для двух амидных протонов остатков Val45 и Leu51 замедленная скорость дейтерообмена не может быть объяснена исходя из полученной в [23] пространственной структуры NtlI, поскольку в этой структуре они экспонированы в растворитель. Поэтому было сделано предположение об образовании симметричного димера Ntü, в котором протоны остатков Val45 и Leu5l участвуют в межмолекулярных водородных связях [23].
Целью настоящей работы было уточнение набора структур NtlI путем минимизации их
II
Рис. 1. Стереоизображение набора из 19 структур N111, полученных в результате минимизации конформационной энергии и совмещенных по тяжелым атомам основной цепи. Показаны только тяжелые атомы основной цепи, а - вид спереди, б - вид сбоку. Римскими цифрами указана нумерация петель.
конформационной энергии и построение пространственной модели димера.
Минимизация конформационной энергии набора структур NtlI, полученных в предыдущей работе [23], позволила оптимизировать пространственную структуру не только по ограничениям на попарные межпротонные расстояния, но и по энергетическим членам. Из результатов статистического анализа наборов структур до и после минимизации конформационной энергии (табл. 1) можно заметить некоторое увеличение среднего попарного среднеквадратичного отклонения (СКО) координат атомов для набора струк-
тур №11 после минимизации энергии, что может быть связано с устранением излишней "зажатос-ти" набора структур. Заметно уменьшение количества и величины нарушений радиусов Ван-дер-Ваальса, а также нарушений ограничений на значения двугранных углов. Полученный набор структур №11 имеет низкую конформационную энергию и хорошо согласуется с экспериментальными данными (табл. 1).
Стереоизображение набора структур №11, полученных в результате минимизации энергии, показано на рис. 1 и 2. Основная цепь молекулы образует плоский диск. На верху молекулы (ориентация
Таблица 1. Конформационная энергия и остаточные нарушения ограничений для 19 структур Ш1 до минимизации конформационной энергии и после. Показаны средние величины и их стандартные отклонения
Параметр До минимизации После минимизации
Энергия ЕСЕРР/2, ккал/моль 725.49 ± 350.72 -291.62 ± 19.73
Нарушения ограничений сверху
Число нарушений >0.2 А 11.0 ± 3.4 14.90 + 2.17
Максимальное нарушение, А 0.35 + 0.08 0.33 ±0.02
Сумма нарушений, А 7.9 ± 1.9 9.92 ±0.87
Нарушение радиусов Ван-дер-Ваальса
Число нарушений >0.2 А 1.2+ 1.1 0.32 ±0.57
Максимальное нарушение, А 0.21 ± 0.05 0.16 ±0.07
Сумма нарушений, А 4.1 ± 1.1 0.56 ±0.19
Нарушение ограничений на углы ср, \|г,
Число нарушений >5° 0.9 ±0.6 0.42 ± 0.49
Максимальное нарушение, град 5.9+1.8 4.97 ± 0.87
Сумма нарушений, град 34.0+ 10.6 13.64 ±2.52
Попарное среднеквадратичное отклонение положения тяжелых атомов, А
Основная цепь 0.53 + 0.12 0.86 ±0.16
Все атомы 1.18 + 0.13 1.48 ±0.19
Рис. 2. Стереоизображение набора из 19 структур №11, полученных в результате минимизации конформационной энергии и совмещенных по всем тяжелым атомам. Показаны все тяжелые атомы, а - вид спереди, б - вид сбоку. Римскими цифрами обозначена нумерация петель.
как на рис. 1) расположено ее ядро, из которого вниз выходят три петли. Вторичная структура образована двухцепочечной {остатки 1 - 5 и 13 - 17) и трехцепрчечной (остатки 22 - 30, 33 - 41 и 50 - 54) антипараллельными р-структурами. Такая укладка полипептидной цепи характерна для всего семейства коротких нейротоксинов.
Минимизация конформационной энергии устранила излишнюю "зажатость" набора структур, что отразилось в увеличившейся дисперсии величин двугранных углов ф и \}/ (рис. 3 в сравнении с рис. 8 в [23]). Все двугранные углы (р и расположены в стерически разрешенных областях карты Рамачандрана (рис, 4). Остатки 01у (19, 33, 39, 41
и 48) попадают в стерически запрещенную для остатков другого типа область (рис. 3, 4). Все перечисленные остатки глицина, кроме С1у19, являются консервативными в семействе нейротоксинов короткого типа. Так как остатки глицина имеют меньшие по сравнению с другими остатками стерические ограничения, их роль заключается, видимо, в обеспечении необходимого направления хода основной цепи в положениях 33, 39, 41 и 48 молекулы, а также необходимой подвижности.
Низкие (<1,5 А) средние локальные значения ОКО практически для всей молекулы (рис. 5) свидетельствуют о хорошо определившейся структуре. Увеличенные значения СКО для ]Ч-концевого
ЬЕСНМООЗ 8дРРТТКТС5СЕТЫСУКК^,Ч ОНКОТ I I ERGCGCPKVKPGVNLNCCRTDRCNN 180 г~гт'1 1111М1 гт~1 I I I I | I I I | | | I |~гг; I ¡с I г I I I ± I I 1 I I I 111 г I I I [ I I г! I I I
Ф О
■180
180
Ф | !
|1 |
■ ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' '
| т 1 I I I I I 1 I I I I I I I I I I I I I I I I г 1 I I I I I I I I I I I I.. I
-180
180
1 10 20 30 40 50 60 ;
ЬЕС!Ш0<35 5(ЗРРТТКТС5ОЕТЫСУК К^ТО Э О Н Я в Т I I ЕЯОСОС РК УК РОУКЬЫССКТОК СЫЫ
Íтт-тl■ I гтл I 1 +1 а: I г I I птм I I Iфтч *ы I I »пттттттгт^т I п
1? 5 ? . * $ I I
I I I I I I I I I I I I I I I
11111
I I I I I I I I
1Т14-1 ....... НП111111
1 10 20 30 40 50 60
Ь ЕС1ШС>(3 5 5 О Р Р Т ТК ГС Э С ЕТГМС УКК\У\*ЛЧ ОН К СГ I I ЕКЦСССРКУКРОУЫЬКССКТРКСКМ I Ф м м -и I I м I I I м м чр^гт ттг : ттптт(г т гтт ( : т ' ' ^ 1111+1114,
*** * $
$ $
* §§* «I г Л»
4 !М|
1 *• 1 1 I. 1 ¥ 1 ч*-1 I I I I т I .1 .*. I 111111111
' ' | £' ' I I =ы ^ I I I I к I I I I I I I
10
20 30 40
Номер остатка
50
60
Рис. 3. Величины двугранных углов <р, у и у} аминокислотных остатков в полученном наборе структур Вверху в однобуквенном коде показана аминокислотная последовательность белка.
остатка, а также петлевых участков 8 - 9, 17 - 21, 29 - 34 и 44 - 47 наблюдались и для других гомологичных нейротоксинов короткого типа (см., например, [19, 20]) и объяснялись увеличенной подвижностью петлевых участков в растворе.
Образование дилеров №//
Система водородных связей для энергетически оптимизированного набора конформаций 1ЧШ аналогична полученной ранее (см. [23]). Внутри-
молекулярные водородные связи были идентифицированы для всех, кроме трех медленно обме-нивающихся амидны? протонов (Уа145, Ьуй46 и Ьеи51). Сигналы от этих протонов сохранялись в спектрах ТОС8¥ спустя 2 ч после растворения образца №11 в 020 при 20°С [23]. Медленный обмен амидного протона остатка Еув46 можно объяснить его низкой доступностью для растворителя. Амид-ные протоны двух других остатков экспонированы в растворитель. Интересно, что не нашедшие объяснения медленные скорости дейтерообм
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.