ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2015, № 3, с. 272-277
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.841
УТОЧНЕНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОГО СТАТУСА БАКТЕРИИ-НЕФТЕДЕСТРУКТОРА МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ АНАЛИЗА КЛЕТОЧНЫХ БЕЛКОВ И ИССЛЕДОВАНИЯ СОСТАВА ЖИРНЫХ КИСЛОТ
© 2015 г. Т. Ю. Коршунова, С. Р. Мухаматдьярова, О. Н. Логинов
Институт биологии УНЦ РАН, 450054 Уфа, просп. Октября, 69 E-mail: korshunovaty@mail.ru Поступила в редакцию 12.03.2014 г.
На основании результатов газовой хроматографии-масс-спектрометрии метиловых эфиров жирных кислот клеточной стенки и матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизацион-ной масс-спектрометрии белков клетки установлена видовая принадлежность штамма бактерии-нефтедеструктора, идентифицированного ранее как Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1.
DOI: 10.7868/S0002332915030054
В последние два десятилетия систематика микроорганизмов претерпела кардинальные изменения благодаря успехам в развитии методов молекулярной биологии, химического анализа и компьютерного программирования, которые существенно повлияли на формирование представлений о филогении микроорганизмов. Но по-прежнему одной из наиболее сложных проблем таксономии бактерий является определение основной таксономической категории — вида. Современная классификация прокариот базируется на полифазном подходе — интегрированном применении различной согласующейся информации о микроорганизмах генотипического, фенотипи-ческого, филогенетического, экологического, а также хемотаксономического характера (Gilles et al, 2001; Tindall et al., 2010).
Хемотаксономические методы идентификации заключаются в определении биохимических маркеров (хинонов, тейхоевых и жирных кислот, пептидов, белков, полинуклеотидов и т.д.), имеющих таксономическую специфичность. Для этого часто применяют масс-спектрометрию, которая основана на генерировании ионов из молекул исследуемых веществ и их разделении в вакууме под действием электрического и/или магнитного поля по отношению массы иона к его заряду. Масс-спектрометрия характеризуется высокой разрешающей способностью и чувствительностью, требует небольших затрат времени и может быть полностью автоматизирована. Полученные результаты анализа сравниваются с базами данных (Sauer, Kliem, 2010).
Анализ метиловых эфиров жирных кислот с помощью газовой хроматографии—масс-спек-трометрии — универсальный метод хемотаксоно-
мического исследования бактерий (Buyer, 2002a, 2006; Новиков и др., 2013). Жирные кислоты клеточных стенок имеют специфические особенности у представителей разных систематических групп бактерий (длина и разветвления углеродной цепи, различное положение двойных связей). Их содержание и соотношение генетически детерминированы и так же консервативны, как и ДНК. Это подтверждается результатами палеонтологических исследований (Shekhovtsova et al., 2003). Следовательно, жирные кислоты можно использовать как для уточнения классификации бактерий, так и для определения их видовой принадлежности (Комаров, 1998; Buyer, 2002b; Осипов и др., 2007). Сегодня состав жирных кислот клеточных стенок многих микроорганизмов изучен, доказана их родо- и видоспецифичность (Компанцева и др., 2007).
В настоящее время для идентификации и классификации микроорганизмов стал широко применяться относительно новый масс-спектромет-рический метод — матрично-активированная лазерная десорбционно-ионизационная (МАЛДИ) масс-спектрометрия (De Bruyne et al., 2011; Veloo et al., 2011; Welker, Moore, 2011; Демидов и др., 2013). Он позволяет проводить прямой масс-спектрометрический анализ белковой фракции микробной клетки (прямое белковое профилирование) без разделения и очистки отдельных белков и получать уникальные для данного вида масс-спектры, тем самым выявляя и идентифицируя маркерные ионы (пептиды и белки), специфичные для видов и подвидов (Dieckmann etal., 2010; Rezzonico et al., 2010; Sato et al., 2011; Присяжная и др., 2012). Кластеризация близких бактерий на основании МАЛДИ-масс-спектров
обычно коррелирует с их группировкой по нук-леотидным последовательностям гена 16S рРНК и другим генотипическим характеристикам (Sa-laun et al., 2010; Воробьёва и др., 2011; Hinse et al, 2011; Присяжная и др., 2012).
От других методов диагностики микроорганизмов метод МАЛДИ-масс-спектрометрии отличается простотой подготовки проб, использованием целых клеток бактерий, грибов и дрожжей, малым количеством необходимого для исследования материала (достаточно одной колонии), высокой скоростью анализа и хорошей воспроизводимостью (Jones et al., 2003; Wahl, Valentine, 2003; Liyanage, Lay, 2006). Однако на сегодня метод имеет и свои ограничения, связанные с отсутствием сведений о МАЛДИ-масс-спектрах большинства типовых штаммов различных видов (имеющиеся данные касаются в основном клинически значимых видов бактерий) (Vargha et al., 2006).
Грамотрицательные бактерии рода Acineto-bacter — свободноживущие гетеротрофы, распространенные практически повсеместно и обладающие метаболической универсальностью. Они играют важную роль в биологическом разложении широкого круга веществ, загрязняющих окружающую среду. Поэтому быстрое и надежное определение видовой принадлежности штаммов рода Acinetobacter с помощью целого комплекса методов, безусловно, важно для повышения эффективности процессов очистки экосистем от различных поллютантов.
Ранее из серой лесной почвы, загрязненной дизельным топливом, авторами был выделен штамм микроорганизмов, который по совокупности культурально-морфологических и физио-лого-биохимических свойств идентифицирован как Acinetobacter sp. Определение нуклеотидной последовательности гена, фланкирующего 16S рРНК, а также филогенетического положения штамма позволило с высокой долей вероятности отнести его к виду Acinetobacter calcoaceticus (Коршунова и др., 2013а). Штамм размещен во Всероссийской коллекции микроорганизмов как Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 под номером VKM B-2753D, а нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК депонирована в GenBank под номером KJ461687. Дальнейшие исследования показали, что бактерия Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 характеризуется высокой окислительной активностью по отношению к широкому кругу нефтяных углеводородов, нефти, нефтепродуктов и разлагает их до конечных веществ — углекислого газа и воды (Коршунова и др., 2013б). Указанный штамм имеет значительный биотехнологический потенциал и может быть использован в качестве основы биопрепарата для очистки окружающей среды от нефтезагрязнения. Следовательно, точное опре-
деление вида этого микроорганизма имеет практическую значимость.
Цель работы — дополнительная идентификация и определение таксономического статуса штамма бактерии-нефтедеструктора Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 с помощью масс-спектрометриче-ских методов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Анализ состава жирных кислот. Пробу сухой биомассы клеток (3—5 мг), выращенных на среде ТSА, обрабатывали в 0.4 мл 1.2 N соляной кислоты в метаноле при 80°C в течение 1 ч. Образовавшиеся при метанолизе метиловые эфиры жирных кислот и другие липидные компоненты экстрагировали гексаном. Последний упаривали, а сухой остаток силилировали в 20 мкл ^0-5ис(триме-тилсилил)трифторацетамида (БСТФА) 15 мин при 80°C для получения триметилсилильных эфи-ров оксикислот и разбавляли гексаном до 100 мкл. Для анализа 1 мкл смеси вводили в инжектор системы газовый хроматограф—масс-спектрометр AT-5850/5973 (Agillent Technologies, США). Квад-рупольный масс-спектрометр имеет разрешающую способность 0.5 атомных единиц масс (а.е.м.), рабочий диапазон 2—950 а.е.м. Ионизация электронами 70 эВ. Чувствительность прибора по метилстеарату составляет 0.01 нг. Для хро-матографического разделения пробы использовали капиллярную колонку из плавленого кварца длиной 25 ми внутренним диаметром 0.25 мм. Хроматографирование проводили в режиме программирования температуры от 140 до 320°C со скоростью 7°C в 1 мин. Температура инжектора и интерфейса составляла 280°C. Данные обрабатывали с помощью штатных программ прибора. Вещества в хроматографических пиках идентифицировали с помощью библиотечных программ базы данных масс-спектров Национального института стандартов и технологий (США) (http:// webbook.nist.gov/chemistry).
МАЛДИ-масс-спектрометрия. Клетки одной колонии, выращенной на среде МПА, переносили на стальную пластинку-мишень с помощью тонкого стерильного шпателя, смешивали с 0.5 мкл раствора матрицы (а-циано-4-гидроксикорич-ная кислота в 50%-ном водном растворе ацето-нитрила, содержавшем 2% трифторуксусной кислоты) и высушивали на воздухе при комнатной температуре.
Спектры регистрировали в линейном режиме с задержанной экстракцией ионов на приборе Au-toflex Speed (Bruker Daltonics, Германия), оснащенном времяпролетным анализатором (время задержки — 350 нс, ускоряющее напряжение — 20 кВ). Запись спектров проводили в режиме положительных ионов; диапазон регистрируемых масс
Состав жирных кислот липидов штамма Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1, представителей рода Acinetobacter (Вейвант и др., 1999) и среднее содержание жирных кислот для 32 штаммов A. calcoaceticus (Yang et al, 2012)
Жирная кислота Название жирной кислоты Оодержание, % суммарного
Acinetobacter sp. ИБ ДТ-5.1/1 Acinetobacter spp. среднее для 32 штаммов A. calcoaceticus
C10:0 Декановая - Оледы 0.05
С12:0 Додекановая 1.53 7 4.51
Unknown 12.484 Обозначение (Yang et al., 2012) - - 0.62
2h-Ci2:0 2-гидроксидодекановая 1.73 2 2
3h-C12:0 3-гидроксидодекановая 1.72 4 3.11
С13:0 Тридекановая - - 0.23
3h-;so-C13:0 3-гидрокси-изо-тридекановая - - 0.48
С14:0 Тетрадекановая 0.75 1 2.02
3h-C14:0 3-гидрокситетрадекановая 0.22 1 2.6*
С15:0 Пентадекановая 0.61 1 1.14
isoH-C15.1 и/или 3h-C13:0** изо-пентадеценовая и/или - - 0.66
isoF-C15:1** 3-гидрокситридекановая - - 0.1
anteiso-C151 изо-пентадеценовая - - 0.38
С16:0 антеизо -пентадеценовая 24.96 20 20.48
C16:1w9c Гексадекановая 0.98 1 0.05
C16:1w7c 7-цис-гексадеценовая 18.86 16 25 1***
C16:1w7t 9-цис-гексадеценовая 0.62 - -
C16:0alc н-гексадеканол 1.2 - -
C16:1alc гексадецен-9-ол 0.33 - -
C17:0 Гептадекановая 1.79 2 1.24
ÍSO-C17:0 изо-
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.