ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2009, том 56, № 4, с. 483-489
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 581.1
УВЕЛИЧЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО ЛИНЕЙНОГО ТРАНСПОРТА ЭЛЕКТРОНОВ У ЦИАНОБАКТЕРИИ ЗупескосуБйБ ер. РСС 6803, ЛИШЕННОЙ ФИКОБИЛИСОМ
© 2009 г. И. Н. Стадничук*, Е. П. Лукашев**, И. В. Еланская**, [В. А. Бойченко***, Н. Г. Бухов****
* Институт биохимии им. АН. Баха Российской академии наук, Москва ** Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва *** Институт фундаментальных проблем биологии Российской академии наук, Пущино **** Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 30.06.2008 г.
Исследовали компенсаторные изменения, происходящие в пигментном аппарате фотосинтеза вследствие полной утраты фикобилисом (ФБС) у клеток PAL-мутанта цианобактерии БупесНосу^ sp. PCC 6803. Соотношение ФБС/хлорофилл, рассчитанное на основании интенсивностей полос в спектрах действия фотосинтетической активности двух фотосистем, составляло у дикого штамма 1 : 70 для ФС II и 1 : 300 - для ФС I. С учетом числа молекул хлорофилла, приходящихся в каждой фотосистеме на один реакционный центр, данные соотношения означали связь ФБС с димерами ФС II и тримерами ФС I и большую степень зависимости ФС II от светопоглощения ФБС в сравнении с ФС I. Соотношение ФС ^ФС II, определенное по фотохимическому сечению реакций двух фотосистем, составило 3.5 : 1.0 для дикого штамма БупесНосу8й8 sp. РСС 6803 и 0.7 : 1.0 - для PAL-мутанта. Пятикратное увеличение доли ФС II в пигментном аппарате, соответствует также пятикратному увеличению интенсивности полос при 685 и 695 нм относительно полосы ФС I при 726 нм, зарегистрированному в низкотемпературном спектре флуоресценции PAL-мутанта. Ингибирование ФС II с помощью диурона приводило к резкому возгоранию флуоресценции хлорофилла у PAL-мутанта в сравнении с диким штаммом БупесНосузйз sp. РСС 6803, означавшему интенсификацию переноса электронов между ФС II и ФС I в мутантных клетках. Тем самым, отсутствие ФБС в мутантном штамме БупесНосу8й8 sp. РСС 6803 компенсируется увеличением доли ФС II в пигментном аппарате фотосинтеза и возрастанием интенсивности линейного транспорта электронов.
Ключевые слова: БупесЬосузйз 6803 - ФС I- ФС II- фикобилисомы
ВВЕДЕНИЕ
Пигментный аппарат оксигенного фотосинтеза состоит из двух взаимодействующих фотосистем, ФС I и ФС II. Фотосистемы связаны цепью линейного транспорта электронов и образованы пигмент-белковыми комплексами, содержащими реакционные центры и собственную, или коровую, хлорофильную антенну. Количество поглощаемых фотосистемами световых квантов является важнейшим фактором, определяющим протекание всех последующих этапов фотосинтетического процесса. Для увеличения светопоглощения фотосистемы включают в свой состав дополнительные антенные пигмент-белковые комплексы, не имеющие собственных реакционных центров и передающие
Сокращение: ФБС - фикобилисомы.
Адрес для корреспонденции: Стадничук Игорь Николаевич. 119071 Москва, Ленинский проспект, 33. Институт биохимии РАН. Факс: 007 (495) 954-14-72; электронная почта: stadnichuk@ mail .ru
поглощенную энергию как ФС II, так и ФС I. У высших растений и зеленых водорослей подобной антенной служит хлорофилл а/в-протеин [1]; у красных водорослей и цианобактерий роль антенны выполняют фикобилисомы (ФБС). Миграция энергии от дополнительной антенны увеличивает число световых квантов, приходящихся на каждый реакционный центр, так как за счет антенны возрастает общее число хромофорных молекул, а абсорбция квантов дополнительными хромофорами происходит в спектральном диапазоне, где поглощение света коровыми пигмент-белковыми комплексами хлорофилла малоэффективно.
Дополнительная антенна является наиболее лабильной частью пигментного аппарата. Хорошо известно, что на избыток освещенности фото-синтезирующая клетка реагирует уменьшением размеров фотосинтетической антенны, что позволяет сохранять протекание первичных процессов фотосинтеза на стабильном физиологиче-
ском уровне. Возникает вопрос об адаптивных возможностях фотосинтетического аппарата в противоположном случае, когда освещенность остается неизменной, а дополнительная антенна уменьшается или полностью исчезает. Иными словами, с помощью каких механизмов фотосинтетический аппарат может компенсировать отсутствие дополнительных пигментов?
Комплекс хлорофилл а/Ь-протеин состоит из нескольких разных полипептидов, что осложняет получение мутантов, полностью свободных от вспомогательной антенны [1]. Более существенным обстоятельством является неустойчивость подобных мутантов в автотрофных условиях роста и потребность в гетеротрофных ростовых добавках для мутантов с блокировкой одного или обоих реакционных центров фотосистем [1]. Переход к гетеротрофному метаболизму ведет к ингибирова-нию активности фотосинтетического аппарата, что не позволяет в полной мере судить об его адаптивных возможностях, компенсирующих инактивацию вспомогательной антенны [2, 3]. Этих недостатков лишен РЛЬ-мутант цианобактерии Буив-chocystis 8р. РСС 6803 (далее Synвchocystis 6803), способный к строго автотрофному росту [4].
Одноклеточная цианобактерия с полностью секвенированным геномом, Synвchocystis 6803, служит наиболее распространенным объектом для изучения функций ФБС. Белковые суперкомплексы ФБС состоят из фикобилипротеинов, в которых ковалентно-связанные с полипептидами фикобилиновые хромофоры передают поглощенную световую энергию на хлорофилл почти со стопроцентной эффективностью [5, 6]. ФБС, имеющие, как правило, молекулярную массу в несколько миллионов дальтон и содержащие в среднем около двухсот хромофорных молекул, примыкают к комплексам ФС I и ФС II, находясь на поверхности тилакоидной мембраны. Для ци-анобактерий характерны ФБС полудисковидной формы, основными фикобилипротеиновыми компонентами которых служат С-фикоцианин и аллофикоцианин. Фикобилипротеиновая антенна РЛЬ-мутанта полностью утрачена вследствие де-леций в генах, кодирующих С-фикоцианин, аллофикоцианин и якорный полипептид, отвечающий за контакт ФБС с пигмент-белковыми комплексами хлорофилла. Входящие в состав ФБС минорные полипептидные компоненты также не синтезируются клеткой, так как их биосинтез жестко скоординирован с образованием перечисленных фикобилипротеинов. Данные иммунологического анализа и флуоресцентной спектроскопии свидетельствуют, что РЛЬ-мутант не содержит фикобилипротеинов [4].
В данной работе изменения, происходящие в пигментном аппарате фотосинтеза при полной утрате ФБС РЛЬ-мутантом Synвchocystis 6803, ис-
следованы в сопоставлении с диким штаммом той же цианобактерии.
МЕТОДИКА
Объекты исследования. Дикий штамм и РЛЬ-мутант (РС-, AapcЛB, ДapcE) Synвchocystis 6803 выращивали в стационарных условиях в модифицированной ростовой среде Бв-11 [7], содержавшей удвоенное количество №N63. Культуры клеток находились при 28°С в 100-миллилитро-вых колбах под люминесцентными лампами белого света при постоянной освещенности 40 мкЕ/(м2 с). Клетки, достигшие оптической плотности 0.6-0.8 при 750 нм, собирали центрифугированием в логарифмической фазе роста, ресуспендировали в ростовой среде или нейтральном буферном растворе и использовали в экспериментах. Мутантный штамм сохранял способность к фотоавтотрофному росту, хотя его скорость уступала скорости роста дикого штамма [4].
Измерение спектров действия фотохимической активности двух фотосистем и определение соотношения ФС 1/ФС II. Активность ФС II определяли по уровню выделения О2 в освещаемой полярографической ячейке. Активность ФС I оценивали по конкурентному к поглощению О2 фотоингибированию клеточного дыхания - эффекту, связанному с пересечением у цианобакте-рий дыхательной и фотосинтетической цепей транспорта электронов на уровне пластохинона. В первом случае регистрацию вели в присутствии слабоинтенсивного длинноволнового красного света, поглощаемого ФС I, чтобы нивелировать влияние циклического транспорта электронов на скорость клеточного выделения кислорода. Во втором случае регистрацию вели в присутствии 20 мкМ диурона, чтобы устранить активность ФС II, искажающую результаты измерений, проводимых независимо для ФС I. Клетки цианобакте-рий, отмытые от ростовой среды и ресуспендиро-ванные в 50 мМ фосфатном буфере рН 6.8, содержавшем 50 мМ КС1, помещали на поверхность платинового микроэлектрода. Объем полярографической ячейки составлял 0.02 мл при толщине слоя клеточной суспензии, равной 0.65 мм, и оптической плотности, не превышавшей 0.1-0.2 при 675 нм по хлорофиллу. Спектры действия обеих фотореакций измеряли в режиме прерывистого освещения, используя вспышки монохроматического света длительностью 1 с и темновыми интервалами 20-60 с, необходимыми для восстановления первоначального уровня фотохимической активности. Оптическая полуширина щели монохроматора составляла 1-6 нм, интенсивность света, освещавшего образец, равнялась 0.10-0.25 мкЕ/(м2 с) в диапазоне длин волн 550-720 нм. Освещенность образца выравнивали для разных длин волн нейтральными светофильтрами с контролем калиброванным
термоэлементом РТС-20С, и поправкой на отражение света поверхностью платинового электрода.
Соотношение реакционных центров ФС I и ФС II в клетках Synechocystis 6803 (отношение ФС I/ФС II) определяли, воздействуя одиночными вспышками света возрастающей интенсивности и разного спектрального состава на ФС II-зависимое выделение 02 и ФС I-зависимое фотоингибирование дыхания. Получали кривые светового насыщения каждой фотореакции с последующим использованием кривых для расчета содержания функционально активных реакционных центров. Длительность световой вспышки от ксеноновой лампы ИСС-100-3М, снабженной световолоконной оптикой от осветителя ОВС-2, составляла 1.8 мкс, что было на порядок меньше времени одного оборота реакционных центров в сопряженной цепи переноса электронов. Возбуждающий свет пропускали через набор отрезающих и интерференционных светофильтров. Все необходимые измерения параметров двух фотосистем, включая спектры действия специфических фотореакций, проводили на одном образце, чт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.