PАДИОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ^^^^^^^^^^ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ ОПУХОЛЕЙ
УДК [57+61]:539.1.04:616-006:613.648.4
УВЕЛИЧЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ОПУХОЛЕВЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ РЕДКОИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ
© 2014 г. И. А. Замулаева*, О. Н. Матчук, Е. И. Селиванова, В. Г. Андреев, Н. М. Липунов, С. А. Макаренко, Л. П. Жаворонков, А. С. Саенко|
Медицинский радиологический научный центр Министерства здравоохранения Российской Федерации, Обнинск
Радиорезистентность опухолевых стволовых клеток (ОСК) рассматривается в качестве одной из возможных причин рецидивирования онкологических заболеваний после лучевой терапии. Поскольку закономерности и механизмы радиационного воздействия на эту популяцию клеток изучены недостаточно, цель данной работы — выяснение количественных изменений популяции ОСК после воздействия у-излучения в стабильных культурах опухолевых клеток in vitro и опухолевой ткани in vivo (в ходе лучевой терапии больных раком верхних дыхательных путей). ОСК идентифицировали с помощью проточной цитометрии по способности исключать флуоресцентный краситель Хёхст 33342 (в клеточных культурах линий B16, MCF-7, HeLa через 48—72 ч после облучения в дозах 1—20 Гр) и по иммунофенотипу CD44+CD24-/Iow (в биопсийном материале через 24 ч после облучения в дозе 10 Гр). Установлены существенные различия в ответе опухолевых стволовых и не стволовых клеток на воздействие редкоионизирующего излучения. Абсолютное количество ОСК увеличивалось после однократного облучения в диапазоне доз от 1 до 5—10 Гр в культурах разных линий, но при дальнейшем повышении дозы сохранялось на достигнутом уровне или уменьшалось. В то же время количество не стволовых клеток значительно снижалось с повышением дозы радиационного воздействия, как и следовало ожидать. При фракционированном облучении in vivo в суммарной очаговой дозе 10 Гр относительное количество ОСК возрастало у большинства больных. Регистрируемые изменения являются интегральным показателем клеточной гибели, задержки деления сразу после облучения, пролиферации в последующее время, возможной дедифференцировки не стволовых клеток и т.д. Точный вклад каждого из этих механизмов в радиационно-индуцированное повышение количества ОСК представляет значительный интерес и требует дальнейших исследований.
Опухолевые стволовые клетки, SP, B 16, MCF-7, HeLa, радиочувствительность, редкоионизирующее излучение, проточная цитометрия.
DOI: 10.7868/S0869803114030187
Гетерогенность опухолевых клеток по морфологическим и функциональным признакам (в том числе по чувствительности к радиационным и химическим воздействиям) является фундаментальным свойством злокачественных опухолей. Поскольку такая гетерогенность во многом определяет эффективность лечения онкологических больных, выяснение разнообразных механизмов ее формирования не теряет своей актуальности уже многие годы. В последнее время активно развивается представление о том, что в злокачественных новообразованиях имеются особые клетки, которые являются родоначальниками гетерогенных клонов, составляющих опухоль. Они отличаются от остальных опухолевых клеток по туморо-генной активности (способности восстанавливать рост исходной опухоли при трансплантации в ор-
* Адресат для корреспонденции: 249036 Обнинск, Калужская обл., ул. Королева, 4, ФГБУ МРНЦ Минздрава России; тел.: (48439) 9-71-88; e-mail: zamulaeva@mail.ru.
ганизм иммунодефицитных мышей) и сходны со стволовыми клетками нормальных тканей по ряду молекулярно-биологических и структурно-функциональных особенностей (профиль генной экспрессии, набор белковых маркеров на поверхности клеток, интенсивное удаление лекарственных препаратов и липофильных красителей и т.д.). Эти клетки получили название опухолевых стволовых клеток (ОСК); в различных литературных источниках их называют также стволовоподобными (stem-like) или опухоль инициирующими клетками (tumor initiating cells). В настоящее время продемонстрировано существование ОСК в злокачественных новообразованиях разной локализации и стабильных линиях опухолевых клеток человека и животных, несмотря на известные сложности идентификации таких клеток [1—11]. Установлено, что ОСК характеризуются более высокой резистентностью к действию редкоионизирующего излучения и ряда химиопрепаратов по сравнению с остальными клетками опухоли, поэтому предпо-
лагают, что именно ОСК определяют неблагоприятные отдаленные результаты радио-, химиотерапии или их комбинации [12—14]. В связи с этим значительный интерес представляет выяснение закономерностей и механизмов радиационного воздействия на ОСК для дальнейшего совершенствования радиотерапии онкологических больных.
Целью данной работы является выяснение количественных изменений ОСК после воздействия у-излучения в культурах опухолевых клеток in vitro и опухолевой ткани in vivo (в ходе лучевой терапии больных раком верхних дыхательных путей).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
В работе использованы два основных метода идентификации ОСК, известные в литературе: иммунофенотипирование по поверхностным маркерам и оценка эффективности исключения из клеток флуоресцентного красителя Хёхст 33 342. ОСК (в отличие от остальных клеток) обладают способностью исключать указанный краситель вследствие высокой экспрессии на плазматической мембране различных АТФ-связыва-ющих транспортеров [2, 15, 16]. Благодаря этой способности ОСК могут быть выявлены с помощью проточной цитометрии как так называемая боковая популяция (side population — SP) в ряде стабильных линий опухолевых клеток, включая использованные в данной работе. При этом для обозначения остальных клеток часто применяется термин non SP (NSP), который принят в данной работе ввиду его распространенности в мировой литературе. Метод выявления SP был использован нами при исследовании клеточных культур, метод иммунофенотипирования — при анализе биопсийного материала злокачественных опухолей.
помощью камеры Горяева и проводили стандартное окрашивание с применением флуоресцентного красителя Хёхст33342 ("Sigma", США) для определения доли клеток SP в изучаемых культурах, как подробно описано в работе [17]. Концентрация Хёхста составляла 5 мкг/мл, время инкубации — 60 мин для клеток линии В 16 и 90 мин для линий MCF-7 и HeLa. Для исключения из анализа мертвых и погибающих клеток в образцы добавляли раствор йодистого пропидия до конечной концентрации 2 мкг/мл за 10—15 мин до анализа. Окрашенные образцы анализировали с помощью проточного цитофлуориметра FACS Vantage ("Becton Dickinson Immunocytometry Systems", BDIS, США), оборудованного двумя лазерами с длинами волн 364 и 488 нм. Флуоресценцию Хёхста измеряли в синей (424 ± 20 нм) и красной (675 ± 20 нм) областях спектра (при ^возб = 364 нм), а также регистрировали флуоресценцию йодистого пропидия при длине волны 585 ± 20 нм (^возб = 488 нм). Для контроля окрашивания использовали параллельные образцы клеток, инкубированных с Хёхстом в присутствии верапамила — блокатора кальциевых каналов I класса, препятствующего выведению Хёх-ста33342 из клеток. Данные собирали в файл, который затем обрабатывали с помощью программы CellQuestPro (BDIS, США). Регион SP выделяли графически для каждой исследуемой культуры отдельно. Как показано на рис. 1 и 2, это осуществляли таким образом для клеток двух линий, что в контрольных образцах с верапа-милом в этот регион попадало минимальное количество клеток. Вычисляли относительное количество (процент) клеток SP и NSP, а затем их абсолютное количество в каждом флаконе. С каждой культурой проведено по 4—5 независимых экспериментов.
Определение количества клеток SP и NSP с помощью проточной цитометрии в культурах опухолевых клеток in vitro
Объектом исследования были клетки мелано-мы мыши линии В16, аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 и рака шейки матки человека линии HeLa, культивируемые в стандартных условиях. По достижении 30—40%-ной конфлюэнтности клетки подвергали воздействию у-излучения 60Со на установке "Луч-1" (Россия) в дозах 1.0—20.0 Гр (мощность дозы 0.9 Гр/мин, средняя энергия 1.253 МэВ). Относительное и абсолютное количество клеток SP оценивали через 48—72 ч после облучения. Определяли общее количество клеток в каждом флаконе с
Определение внутриклеточного содержания виментина в клетках SP и NSP линии HeLa с помощью лазерной сканирующей микроскопии
SP и NSP сортировали с помощью проточного цитофлуориметра FACS Vantage на предметные стекла по 2 тыс. клеток через 48 ч после облучения в дозах 1.0—10.0 Гр на установке "Луч-1". В качестве контроля использовали клетки SP и NSP, отсортированные из необлученных образцов. Клетки фиксировали в ацетоне при —20°С в течение 20 мин, затем инкубировали с моноклональными антителами к виментину, меченными фикоэ-ритрином (BDIS, США), в соответствии с инструкцией производителя в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте. Далее клетки
0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000
FL5 FL5
Рис. 1. Графики распределения клеток линии В 16 по интенсивности флуоресценции Хёхста33342. Приведены результаты одного из типичных экспериментов: А — препарат клеток без верапамила; Б — препарат клеток после инкубации с верапамилом. Выделены регионы клеток SP и NSP; указана доля клеток SP; на каждом графике показано 30 тыс. клеток.
По оси абсцисс (FL5) — интенсивность флуоресценции в красной области спектра (X = 675 ± 20 нм); по оси ординат (FL4) — интенсивность флуоресценции в синей области спектра (X = 424 ± 20 нм).
дважды отмывали от не связавшихся антител в 0.01 моль/л фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7.2) и заключали в среду MOUNT-QUICK ("Daido Sangyo CO., LTD", Япония). Анализ образцов проводили с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica 4000 TCS SPE ("Leica Microsystems", Германия) со спектральной детекцией на многоканальном анализаторе. В качестве источника возбуждения использовали твердотельный лазер с длиной волны 488 нм, регистрацию флуоресценции производили в диапазоне 550—610 нм. Последующую работу по обработке полученных изображений проводили в программе Imaris 7.2.3 ("Bitplane AG", Швейцария). Определяли среднюю интенси
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.