научная статья по теме В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ УАБАИН ИНДУЦИРУЕТ RHO-ЗАВИСИМУЮ АКТИВАЦИЮ ROCK И БЛЕББИНГ МЕМБРАН Биология

Текст научной статьи на тему «В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ УАБАИН ИНДУЦИРУЕТ RHO-ЗАВИСИМУЮ АКТИВАЦИЮ ROCK И БЛЕББИНГ МЕМБРАН»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 1, с. 158-164

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

УДК 577.18;57.052.6

В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ УАБАИН ИНДУЦИРУЕТ Rho-ЗАВИСИМУЮ АКТИВАЦИЮ ROCK

И БЛЕББИНГ МЕМБРАН*

© 2015 г. A. Özdemir1, B. ibi^oglu1, Y. D. §imay1, B. Polat2, M. Ark1*

department of Pharmacology, Gazi University, Faculty of Pharmacy, Turkey 2Department of Perinatology, Zekai TahirBurak MaternityHospital, Turkey Поступила в редакцию 14.03.2014 г. Принята в печать 25.06.2014 г.

Малый G-белок Rho и его самые изученные эффекторы, ROCK I и ROCK II, задействованы в нескольких функциональных процессах клетки, в том числе сокращения гладкомышечных и немышечных клеток, миграции и апоптоза. Активация ROCK I каспазой-3, а ROCK II гранзимом В — важные звенья процесса деформации мембран, так называемого блеббинга, или "пузырения", в деградационной фазе апоптоза. В то же время обнаружено, что сигналинг Rho играет ключевую роль при блеббинге, развивающемся после удаления сыворотки. Ранее показано, что уабаин индуцирует блеббинг мембран и протео-литическое расщепление ROCK I и ROCK II каспазами в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC). Задача данного исследования состояла в идентификации возможной роли Rho в уабаин-индуци-руемом блеббинге мембран. В эндотелиальных клетках уабаин индуцировал, по концентрационно-зависимо-му принципу, клеточную смерть и мембранный блеббинг. Предварительная обработка эндотелиальных клеток Rho-ингибитором CT04 не отменяла уабаин-индуцированную клеточную смерть, но предотвращала формирование пузырей. Следовательно, в клетках HUVEC при индуцируемой уабаином клеточной смерти образование пузырей зависит от активности Rho. На основании полученных результатов можно полагать, что механизм формирования мембранных пузырей может быть различным — в зависимости от типа клетки и сигнала клеточной смерти.

Ключевые слова: Rho, Rho-киназа, апоптоз, мембранный блеббинг ("пузырение" мембраны), уабаин.

OUABAIN INDUCES Rho-DEPENDENT ROCK ACTIVATION AND MEMBRANE BLEBBING IN CULTURED ENDOTHELIAL CELLS, by A. Özdemir1, B. ibi§oglu1, Y. D. Simay1, B. Polat2, M. Ark1* ^Department of Pharmacology, Gazi University, Faculty of Pharmacy, Turkey; *e-mail: mark@gazi.edu.tr; 2Department of Perinatology, Zekai TahirBurak MaternityHospital, Turkey). Small G protein Rho and its most studied effectors, ROCK I and ROCK II, are involved in several cellular fuctions including smooth muscle and non-muscle cell contractions, cell migration and apoptosis. Activation of ROCK I by caspase-3 and activation of ROCK II by granzyme B are essential for membrane blebbing in the execution phase of apoptosis. In contrast, it has been demonstrated that Rho signaling is critical for blebbing developed after serum removal. As it was shown by us previously, ouabain induces membrane blebbing and proteolitic cleavage of ROCK I and ROCK II via caspases in human umbilical endothelial cells. However, caspase inhibitors do not prevent ouabain-induced blebs. Ouabain induces concentration-dependent cell death and membrane blebbing in endothelial cells.The aim of this study was to identify the possible role of Rho in ouabain-induced membrane blebbing. Pretreatment of endothelial cells with a Rho inhibitor CT04 did not inhibit the ouabain-induced cell death but prevented the development of bleb formation.These results indicate that bleb formation is dependent on Rho activity in ouabain-induced cell death in HUVECs. Taken together, these results suggest that the mechanism of membrane bleb formation might be different depending on cell type and cell death-stimuli.

Keywords: Rho, Rho kinase, apoptosis, membrane blebbing, ouabain.

DOi: 10.7868/S0026898415010139

# Статья представлена на английском языке.

* Эл. почта: mark@gazi.edu.tr

ВВЕДЕНИЕ

Мембранные пузыри, которые есть не что иное, как динамичные, регулируемые цитоскелетом выпячивания клеточной мембраны, появляются в ответ на внешний или внутриклеточный сигнал. Мембранный блеббинг ("пузырение", или "вскипание" мембран) инициируется серией событий. Прежде всего, увеличение уровня фосфорилирова-ния миозина II ведет к сокращению кортикального кольца актина. Затем, вследствие увеличения внутриклеточного гидростатического давления, связи между клеточной мембраной и кортикальными участками актина разрушаются, что проводит к блеббингу [1, 2]. Показано, что мембранные пузыри формируются в определенных физиологических и патологических ситуациях, таких как инвазия раковой клетки [3], распластывание клеток [4], цитокинез [5, 6] и апоптоз [7—9].

Rho-семейство малых ГТФаз вовлечено в генерацию сигналов активации миозина II, который необходим для образования пузырей [10]. Изоформы Rho-ассоциированных протеинкиназ (ROCK I and ROCK II) — это первые известные "downstream''-эффекторы малых ГТФаз Rho А [11]. Связывание активного GTP-Rho A с ROCK индуцирует активацию последнего благодаря разрушению взаимодействия между каталитическим N-концевым и С-концевым доменами ROCK [12]. Активная форма ROCK фосфорилирует легкую цепь миозина (MLC) — регуляторный домен миозина II, тем самым активируя сократимость акто-миозина. Кроме того, ROCK стимулирует взаимодействие актин—миозин косвенно — фосфори-лированием MLC-фосфатазы (MLCP) [13].

В двух независимых исследованиях показано, что ROCK I расщепляется каспазой-3 и после этого вовлекается в процесс блеббинга во время деградационной фазы апоптоза [7, 8]. По этому механизму, после стимуляции апоптоза, активная каспаза-3 расщепляет ROCK I. Сразу после удаления С-концевого ингибиторного домена ки-назная активность ROCK I увеличивается. Эта усеченная активная форма ROCK I индуцирует фосфорилирование MLC и MLCP, что приводит к сокращению кортикального слоя клетки и формированию мембранного блеббинга. Из этого можно заключить, что этот тип блеббинга регулируется по Rho-независимому пути.

Как обнаружено нами в 2005 г., ROCK II подвергается фрагментации в плацентах преэкламп-тических состояний — подобно ROCK I при апо-птозе [14]. После этого Себах (Sebbagh) и др. [15] выяснили молекулярный механизм и роль такой фрагментации, а именно: гранзим B расщепляет ROCK II, и его усеченная активная форма индуцирует мембранный блеббинг в отсутствие активации каспаз — в ходе апоптоза, вызванного гранулами цитотоксических лимфоцитов.

Но также известно, что Rho способствует не-апоптотическому мембранному блеббингу в процессе инвазии раковых клеток, и для этого не требуется протеолитическое расщепление ROCK [16].

Есть данные по цитотоксическому действию уабаина на клетки. Акимова (Akimova) и др. [17] показали, что уабаин индуцирует клеточную смерть в эпителиальных клетак почки и эндоте-лиальных клетках кровеносных сосудов независимо от величины соотношения [Na+]i/[K+]i. Более того, в некоторых линиях раковых клеток для уабаина обнаружена апоптотическая и анти-пролиферативная активность. Считается, что механизм уабаин-индуцированного ингибирования клеточной пролиферации зависит от ингибиро-вания каталитической активности топоизомера-зы II [18]. Кроме того, обработка клеток уабаином приводит к высвобождению цитохрома с в цито-золь и индуцирует активацию каспазы-3, что ведет к стимуляции апоптотического пути [19]. Стоит сказать, что точный(е) механизм(ы) этих воздействий еще предстоит выяснить.

Ранее нами показано [9], что уабаин индуцирует апоптоз в клетках HUVEC, и это обусловлено про-теолитическим расщеплением как ROCK I, так и ROCK II соответственно каспазой-3 и каспазой-2. Так как действие специфического ROCK-ингиби-тора Y27632 предотвращало образование мембранных пузырей, мы предположили, что уабаин-ин-дуцируемый блеббинг мембран — процесс ROCK-зависимый для этого типа клеточной смерти в культуре HUVEC. Интересно, что при уабаин-индуцированном расщеплении ROCK II образуется новая усеченная форма белка с молекулярной массой 140 кДа [9]. Кроме того, было обнаружено, что после инкубации с уабаином ROCK активируется и индуцирует апоптотический блеббинг мембран в эндотелиальных клетках, но осталось неизвестным, какая форма ROCK, полноразмерный и/или его усеченная, генерирует этот процесс. Вот почему в данном исследовании мы задались вопросом, требуется ли Rho для мембранного блеббинга в клетках HUVEC при индуцируемой уабаином клеточной смерти.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Культура клеток. Клетки HUVECs получали из пуповины человека. Клетки собирали расщеплением коллагеназы типа II ("PAA Laboratories") и высевали на покрытые 1%-ым желатином культу-ральные флаконы в среду М199, содержащую 10%-ю эмбриональную бычью сыворотку ("PAA Laboratories"), 0.135% NaHCO3, 15 мМ HEPES (pH 7.4), 2 мМ глутамина, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивировали при 37°C в увлажненном инкубаторе с 95% воздуха и 5% CO2. Культуральную среду ме-

160

ÖZDEMIR и др.

няли ежедневно. В экспериментах использовали клетки, достигшие 70—80% конфлюэнтности. Эн-дотелиальные клетки предварительно инкубировали с CT04 (мембранпроникающий экзофермент СЗ-трансфераза Clostridium botulinum; "Cytoskele-ton") в течение 2 ч, после чего клетки обрабатывали уабаином ("Sigma"). Случайным образом выбирали три различных поля и исследовали клетки с использованием фазово-контрастной микроскопии. На полученных фотографиях подсчитывали число нормальных и "пузырящихся" клеток. Процентное содержание последних рассчитывали по уравнению:

% пузырящихся клеток = (число пузырящихся клеток/число клеток в норме) х 100%.

Мониторинг в режиме реального времени прикрепления/открепления клеток. Для определения цитотоксического потенциала уабаина использована система xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (RTCA) DP system ("Roche") [20]. Клетки высевали на электронный планшет, e-plate. На следующие сутки среду меняли. Значения клеточного индекса (CI), индикатора прикрепления/открепления клеток, регистрировали и анализировали с помощью программного обеспечения RTCA. Пока клетки прикрепляются к поверхности e-plate и пролиферируют, величина CI растет; когда она выходит на плато, клетки обрабатывают уабаи-ном в различ

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»