ЖУРНАЛ ОБЩЕЙ БИОЛОГИИ, 2014, том 75, № 6, с. 466-477
УДК 577.21.088.7:574.21:594.381.5
В ПОПУЛЯЦИИ МОЛЛЮСКОВ LYMNAEA STAGNALIS ИЗ РАДИАЦИ-ОННО-НЕБЛАГОПОЛУЧНОГО РЕГИОНА ОБНАРУЖЕНО ДВУКРАТНОЕ УВЕЛИЧЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ДНК В ГЕМОЦИТАХ
© 2014 г. О. Ю. Конева
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси 220072Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: koneva@tut.by
Поступила в редакцию 10.04.2014 г.
С помощью метода ДНК-комет проведены исследования гемоцитов лабораторных культур моллюсков - прудовиков Lymnaea stagnalis, происходящих из двух районов вблизи Чернобыля с различной радиационной нагрузкой. Посредством программного анализа изображений ДНК-комет выявлены статистически значимые межпопуляционные различия: гемоциты моллюсков радиаци-онно неблагополучной популяции Переток содержат удвоенное количество ДНК по сравнению с популяцией затоки р. Припять, а также статистически более устойчивы к воздействию стронция. Стронций снижает количество ДНК в гемоцитах, при этом для моллюсков L. stagnalis значимой (оказывающей негативное воздействие) является уже доза 0.5 ПДК Sr. Согласно ранее проведенному RAPD-анализу, моллюски двух популяций характеризуются высоким генетическим сходством, на основании чего высказывается гипотеза о том, что обнаруженные отличия в содержании ДНК гемоцитов и устойчивости к стронцию наследуются как адаптивная длительная модификация (эпигенетическое изменение) в ответ на интенсивные повреждающие действия окружающей среды. Метод ДНК-комет может выступать его индикатором при экологическом мониторинге.
Одной из составляющих качества жизни организма является экологическое состояние окружающей его среды. В результате антропогенного воздействия происходит все возрастающее загрязнение окружающей среды, сопровождающееся выбросом и накоплением в ней генотоксикантов. Для оценки повреждающего воздействия этих соединений на ДНК используются различные методы, условно разделяемые на две группы. К первой группе относятся методы, основанные на регистрации цитогенетических эффектов (хромосомные аберрации, образование микроядер), ко второй - методы, основанные на регистрации молекулярных изменений (наличие повреждений непосредственно в молекулах ДНК и их качественный и количественный анализ) (Сирота, Кузнецова, 2010).
В 1978 г. был опубликован метод измерения повреждений ДНК в одиночных клетках, основанный на миграции ДНК в электрическом поле (Rydberg, Johanson, 1978; Ostling, Johanson, 1984). Этот метод, получивший наименование ДНК-комет, используется как стандартная методика для оценки уровня повреждений/репарации ДНК, биомониторинга, генотоксического тестирования, клинических исследований (Rojas et al., 1999;
Collins, 2004). Метод является высокочувствительным и позволяет оценить количество генетических повреждений клеток на индивидуальном уровне и их степень.
В настоящее время существуют два варианта метода ДНК-комет: нейтральный и щелочной, а также их модификации с использованием ферментов репарации ДНК. Нейтральная версия метода (Olive et al., 1991) ориентирована в основном на анализ двунитевых разрывов ДНК, частота которых в 20-40 раз меньше, чем однонитевых разрывов. Щелочной вариант метода (Singh et al., 1988) позволяет выявлять более широкий спектр повреждений ДНК. В этом варианте в результате введения этапа щелочной денатурации и электрофореза при pH > 13 возможно выявление всех видов повреждений, приводящих к разрывам цепей ДНК и их расхождению, т.е. обнаруживаются од-нонитевые разрывы, щелочелабильные сайты (реализованные в разрывы) и двунитевые разрывы (Singh et al., 1988). Модификация метода со щелочной обработкой и проведением электрофореза при pH < 12.6 позволяет выявлять вклад только од-нонитевых разрывов, так как при таких значениях pH не происходит разрушения щелочелабильных
сайтов и превращения их в разрывы цепей ДНК (Rojas et al., 1999; Сирота, Кузнецова, 2010). Современные модификации метода ДНК-комет также позволяют выявлять и количественно оценивать наличие сшивок и поврежденных оснований ДНК; выявлять клетки, находящиеся в состоянии апоп-тоза и некроза; изучать кинетику восстановления ДНК от разрывов (Сирота, Кузнецова, 2010).
Метод ДНК-комет является также прекрасным методом оценки содержания ДНК в единичной клетке. Так, в работе Крушевского и соав. (Kruszewski et al., 2012) обосновывается предположение, что общая флуоресценция ДНК- комет (зависящая от содержания ДНК в клетке) соответствует позиции клетки в клеточном цикле и может быть использована для отнесения единичной клетки к специфической фазе клеточного цикла. Проведенный авторами (Kruszewski et al., 2012) анализ распределения лимфоцитов CD34+ на основе метода электрофореза одиночных клеток показал, что достаточно 100 ДНК-комет для получения достоверного распределения клеточного цикла, сравнимого с результатами, полученными с помощью проточной цитометрии для этой же клеточной популяции.
Метод ДНК-комет состоит в следующем: образцы тканей, извлеченные либо из in vitro клеточных культур, либо из тестируемых in vivo субъектов, диспергируют до отдельных клеток и суспензируют в 0.5-1%-ной легкоплавкой ага-розе при +37 °С. Полученную суспензию заливают на предметное стекло и сверху покрывают покровным стеклом. Покровное стекло слегка вдавливают в агарозу, в результате чего между покровным и предметным стеклами формируется тонкий слой расплавленной агарозы с включенными в нее жизнеспособными клетками. Ага-розу оставляют застывать при +4 °С, после чего покровное стекло удаляют. Агароза формирует матрикс из углеводных волокон, которые инкапсулируют клетки, закрепляют их на одном месте (Wikipedia, Comet assay). Если есть необходимость, то с этими цитологическими препаратами можно проводить различные манипуляции: подвергать воздействию ионизирующих или неио-низирующих излучений, модельных генотокси-кантов и т.д. (Singh et al., 1988; Rojas et al., 1999; Сирота, Кузнецова, 2010).
Далее предметные стекла погружают в раствор для лизиса клеток. Лизирующий буфер, использующийся при методе ДНК-комет, представляет собой высококонцентрированный водный раствор соли с добавлением детергента (Singh et al., 1988). Значение pH лизирующего раствора выбирают
между нейтральным или щелочным в зависимости от типа повреждений ДНК, которые исследователь изучает. Под действием лизирующего раствора клетка разрушается. Белки, РНК, мембраны, другие цитоплазматические и ядерные компоненты с легкостью диффундируют в ага-розный гель, за исключением ДНК с ее чрезвычайно высоким молекулярным весом. Оставшаяся ДНК раскручивается и заполняет полость в ага-розе, которую ранее сформировала целая клетка (Ostling, Johanson, 1984; Wikipedia, Comet assay). В результате получаются препараты, содержащие нуклеоиды индивидуальных клеток: структуры, в которых петли ДНК (суперскрученные и релак-сированные) прикреплены к белкам ядерного ма-трикса (Сирота, Кузнецова, 2010).
После лизиса клеток предметные стекла промывают в дистиллированной воде, чтобы удалить все соли, и погружают во второй раствор - электрофо-ретический буфер. pH этого раствора может регулироваться в зависимости от типа повреждений, которые исследуются. Предметные стекла оставляют приблизительно на 20 мин в электрофорети-ческом буфере, прежде чем приложить электрическое напряжение. Затем нуклеоиды подвергаются недлительному (около 20 мин) воздействию электрического поля (обычно 1 В/см) (Wikipedia, Comet assay). Во время электрофореза ДНК, которая повреждена и вследствие чего менее уплотнена, будет частично освобождаться из полости и мигрировать к аноду (Ostling, Johanson, 1984).
Далее предметные стекла нейтрализуют до pH = 7.0, окрашивают ДНК-специфическим флуоресцентным красителем и анализируют с помощью флуоресцентного микроскопа. После получения изображений ДНК-комет их обработка может быть произведена визуально или автоматически с помощью специального программного обеспечения.
ДНК, которая мигрирует к аноду, получила название "хвост", а остаток в полости - "центр", "ядро", "голова" либо "нуклеоид". При большом увеличении (*100) в конце хвоста может быть видна волокнистая структура. Смещение ДНК относительно ядра используется как индикатор повреждения ДНК (Ostling, Johanson, 1984; Olive et al., 1991; Сирота, Кузнецова, 2010).
Оценку поврежденности ДНК при визуальном анализе проводят путем ранжирования "комет" по классам миграции или с использованием объект-микрометра для определения длины всей "кометы" или только ее хвоста. "Кометы" ранжируют на пять условных типов с соответствующим для каждого типа числовым индексом от 0 до 4.
Расчет индекса комет (степени поврежденно-сти ДНК) проводится по формуле Ялошинского и соав. (Jaloszynski et al., 1997). В работах российских исследователей эта формула встречается в несколько измененной форме (Myazint et al., 2002). С математической точки зрения обе формулы дают идентичные результаты.
В результате программного анализа изображений получают разнообразные параметры ДНК-комет. Наиболее значимые из них следующие: длина ДНК-кометы, доля ДНК в голове "кометы", доля ДНК в хвосте "кометы", момент хвоста (произведение длины ДНК-кометы на долю ДНК в хвосте "кометы"), момент хвоста по Оливе (произведение расстояния между центром головы "кометы" и центром тяжести хвоста "кометы" на долю ДНК в хвосте "кометы") (Olive et al., 1990). Наиболее часто в публикациях приводятся данные по доле ДНК в хвосте "кометы" и моменту хвоста по Оливе.
Электрофорез одиночных клеток (или метод ДНК-комет) является простым и чувствительным методом флуоресцентной микроскопии, позволяющим обнаруживать первичные повреждения ДНК на уровне отдельных эукариотиче-ских клеток практически любой ткани организма. Возможность количественно измерить разнородность в ДНК-повреждениях является важным атрибутом этого метода. Быстрота исполнения, доступность и сравнительная дешевизна реактивов, малое количество биологического материала, требующегося для анализа (полученного зачастую неинвазивным путем), делают метод ДНК-комет востребованным в экологических исследованиях (Collins, 2004; Сирота, Кузнецова, 2010).
О
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.