научная статья по теме В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИИ КОНТАКТИН-1 РЕГУЛИРУЕТ МИГРАЦИЮ КЛЕТОК MKN45 ЧЕРЕЗ РЕГУЛЯЦИЮ RHOA Биология

Текст научной статьи на тему «В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИИ КОНТАКТИН-1 РЕГУЛИРУЕТ МИГРАЦИЮ КЛЕТОК MKN45 ЧЕРЕЗ РЕГУЛЯЦИЮ RHOA»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

УДК 577.18;57.052.6

В УСЛОВИЯХ ГИПОКСИИ КОНТАКТИН-1 РЕГУЛИРУЕТ МИГРАЦИЮ КЛЕТОК MKN45 ЧЕРЕЗ РЕГУЛЯЦИЮ RhoA#

© 2015 г. G. Yang1f, J.-G. Song2% Y. Li3, S.-P. Gong4*

1The 309th Hospital of PLA, Xishan out-patient Department, Beijing, 100091, P.R China 2Department of Gastroenterology, the 309th Hospital of PLA, Beijing, 100091, P.R China 3Department of Oncology, Kunming General Hospital of Chengdu military force, Kunming, 650032, China 4Department of Obstetrics and Gynecology in Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guang zhou 510515, China

Поступила в редакцию 19.04.2014 г.

Принята в печать 12.05.2014 г.

Недавно показано, что контактин-1 играет ключевую роль в пролиферации и миграции раковых клеток, однако детальный механизм его действия пока неизвестен. Нами показано, что в клетках рака желудка линии MKN45 в условиях гипоксии уровни экспрессии как мРНК, так и белка контактин-1 увеличиваются при экспрессии HIF-1a. Хотя при гипоксии скорость миграции клеток MKN45 увеличивается, их обработка короткими шпилечными РНК ^РНК), нацеленными на ген контактина-1 (CNTN1), обращает этот процесс вспять. В то же время при использовании мутантных конструктов RhoA V14 и RhoA N19 обнаружено, что конститутивно активная форма RhoA предотвращает снижение миграции клеток, вызванное нокдауном CNTN1, в то время как доминантно-негативная форма RhoA блокирует вызываемую гипоксией усиленную миграцию. Кроме того, выявлена способность контактина-1 фосфорилировать активатор RhoA — белок p115 RhoGEF. Таким образом, в условиях гипоксии повышение уровня HIF-1a, по всей видимости, усиливает экспрессию контактина-1, тем самым активируя RhoA и способствуя миграции раковых клеток.

Ключевые слова: гипоксия, контактин-1, CNTN1, RhoA, p115.

UNDER HYPOXIA CONDITION CONTACTIN-1 REGULATES MIGRATION OF MKN45 CELLS THROUGH RhoA PATHWAY, by G. Yang1?, J.-G. Song2?, Y. Li3, S.-P. Gong4* (*The 309th Hospital of PLA, Xishan out-patient Department, Beijing, 100091, P.R China; 2Department of Gastroenterology, the 309th Hospital of PLA, Beijing, 100091, P.R China; 3Department of Oncology, Kunming General Hospital of Chengdu military force, Kunming, 650 032, China; 4Department of Obstetrics and Gynecology in Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guang zhou 510515, China; *e-mail: gsp2103@hotmail.com). Recent studies have suggested that contactin-1 has a key role in cancer cell proliferation and migration, however the detailed mechanism of this process is still unclear. Here, human gastric cancer cell line MKN45 was employed. It was found that under hypoxia conditions contactin-1 mRNA and protein levels were both up-regulated by HIF-1a expression. Furthermore, although hypoxia increased the migration rate of MKN45 cells, contactin-1 (CNTN1) shRNA reversed this process. Meanwhile, RhoA V14 and RhoA V14N19mutation constructs were employed, and it was found that constitutively active form of RhoA reversed the cell migration suppression induced by contactin-1 knockdown, while dominant-negative form of RhoA blocked hypoxia induced hypermigration. Apart from this, contactin-1 displayed the ability to phospho-rylate the RhoA activator p115 RhoGEF. Thus, under hypoxia conditions, elevated HIF-1a seems to up-regulate con-tactin-1 expression and by this activate RhoA and facilitate migration of cancer cells.

Keywords: hypoxia, contactin-1, CNTN1, RhoA, p115. DOI: 10.7868/S0026898415010188

ВВЕДЕНИЕ

Согласно мировой статистике, по летальным исходам от онкологических заболеваний рак желудка "занимает" второе место у мужчин и чет-

^ Эти авторы внесли одинаковый вклад в работу.

# Статья представлена на английском языке.

* Эл. почта: gsp2103@hotmail.com

вертое у женщин — ежегодно приблизительно 800000 человека умирает от этой болезни [1]. Гетерогенность клеток опухолей — основная причина неудач противоопухолевой терапии [2]. Рак желудка относится к быстро метастазирующим опу-

9

129

холям, поэтому одним из универсальных направлений их терапии может быть таргетинг новооб-разующихся сосудов — как существенных компонентов злокачественного процесса [3]. В процесс миграции опухоли вовлечен огромный репертуар белков, одни из которых задействованы в передаче сигналов, вторые в адгезии к мембранам, а третьи в формировании цитоскелета [4—6]. Среди этих белков наиболее значимым фактором, определяющим миграцию клеток, считают белки цитоскелета, которые непосредственно контролируют перемещение клеток.

Как известно, белок RhoA — небольшой белок с ГТФазной активностью, член семейства A генов, гомологичных Ras, — принимает участие в регуляции актинового цитоскелета при формировании стрессовых волокон и играет существенную роль в миграции и инвазии раковых клеток

[7]. Активированный RhoA перемещается из ци-тозоля в примембранные области, где фосфори-лирует разнообразные киназы, которые начинают каскадную передачу сигнала. По этому пути RhoA регулирует сборку сократительных актино-миозиновых филаментов, полимеризацию актина и адгезию клеток.

Контактин-1 (ген CNTN1) относится к глико-зилфосфатидилинозитол-заякоренным молекулам адгезии нервных клеток и входит в подгруппу контактинов суперсемейства иммуноглобулинов

[8]. Контактин-1 может связываться с несколькими белками на поверхности клетки и, по всей видимости, участвует в различных сигнальных путях и клеточных функциях [9]. Недавно сообщалось, что контактин-1 вовлечен в процесс множественного метастазирования злокачественных опухолей человека, включая аденокарциному легкого и рак желудка [10, 11]. В случае аденокарциномы легкого показано, что увеличенный уровень контактина-1 снижает экспрессию E-кадгерина через сигнальный путь AKT, тем самым способствуя миграции клеток опухоли [12]. В случае же рака желудка роль контактина-1 пока неясна.

Поскольку многие виды опухолей развиваются в условиях гипоксия, можно полагать, что эта среда способствует выживанию и миграции клеток рака желудка. В данной работе наше внимание было сфокусировано на вопросе, может ли контактин-1 быть участником вызванной гипоксией миграции клеток рака желудка, а также связанных с этим процессом путей реорганизации цитоскелета.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Плазмиды. Конструкт человеческого гена RhoA с HA-тэгом приобретен у компании "OriGene" (США), конститутивно активная и доминантно-негативная формы RhoA, содержащие соответ-

ствующие мутации G14V и T19N, получали сайт-направленным мутагенезом с использованием системы PCR Quick change с ДНК-поли-меразой PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase ("Agilent", США) и с последующей обработкой ДНК-матрицы эндонуклеазой рестрикции DpnI. Синтезированные олигонуклеотиды для нокдауна генов человека: CNTN1 (5'-ACAGAAA-GATGCTGGAATATA-3') и HIF-1a (5'-AAGCA-TTTCTCTCATTTCCTCATGG-3') - отжигали и ли-гировали в вектор pSUPER (по сайтам XbaI/EcoRI).

Антитела. Мышиные моноклональные антитела к HIF-1a и ß-актину приобретены у компании "Sigma"; кроличьи поликлональные антитела к контактину-1 и фосфосерину — у фирмы "Abcam"; анти-р115-антитела — у "Santa Cruz".

Культивирование и трансфекция клеток. Клетки рака желудка человека линии MKN45 (Шанхайский институт биохимии и клеточной биологии Китайской академии наук, Китай/Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, China) поддерживали в среде RP-MI-1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки ("Gibco", США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина ("Gibco") при 37°C, 5% CO2 и 95% воздуха. Для транс-фекции к клеткам добавляли сверхэкспрессирую-щий конструкт (1 мкг) либо конструкт shРНК (2мкг) с липофектамином-2000 ("Invitrogen"). После инкубации в течение 48 ч (для сверхэкспрессии) или 72 ч (для shPH^) клетки или подвергали гипоксии, или сразу собирали для последующего выделения белка/РНК.

Гипоксическая и нормоксическая обработка.

Условия гипоксии создавали в воздухонепроницаемой камере, деоксигенированной с помощью постоянного притока гипоксической газовой смеси (37°C, 5% CO2, 1% O2, 94% N2). Содержание O2 отслеживали с помощью 02-анализатора. Аналогичным образом нормоксические условия поддерживали в стандартном инкубаторе (37°C, 5% CO2, 20% O2, остальное N2).

Анализ миграции клеток. Для анализа перемещения клеток использована модифицированная камера Бойдена с фильтрующими вставками (размер пор 8 мкм), покрытыми матригелем (40 мкг; "BD Biosciences", США) в 24-луночных планшетах, как описано ранее [13]. Вкратце, клетки (1 х 105 клеток) в 300 мкл бессывороточной среды добавляли в верхнюю камеру, а нижнюю камеру заполняли RPMI-1640 в качестве хе-моаттрактанта. После 18 ч инкубации при 37°C не переместившиеся клетки удаляли из верхней камеры, фильтры фиксировали метанолом и окрашивали с помощью 0.1%-ого раствора кристаллического фиолетового в течение 15 мин. Количество мигрировавших клеток подсчитывали вручную как

сумму пяти случайным образом выбранных полей микроскопа при 10-кратном увеличении.

Анализ активированного RhoA. Набор для ко-иммунопреципитации RhoA, в том числе гранулы с GST-RhoAtekin-RhoA-связывающим доменом, приобретены у компании "Cytoskeleton" (США). Активность RhoA измеряли с помощью набора для коиммунопреципитации RhoA в соответствии с инструкцией производителя. Кратко, клетки MKN45, прошедшие через различные обработки или трансфицированные различными конструктами, вносили в 500 мкл лизирующего буфера, входящего в набор. Один и тот же объем соответствующих супернатантов инкубировали с аффинными микрогранулами RhoAtekin-RBD в течение 1 ч при 4°C, а затем промывали дважды лизирующим буфером и трижды буфером для промывки, входящим в набор. Связавшиеся белки элюировали с помощью буфера для нанесения на гель, содержащий 1% SDS, разделяли в 12%-ом SDS-ПААГ и анализировали методом вестерн-блотинга с антителами против RhoA. Аликвоты, взятые из суммарного лизата, использовали также для измерения общего количества белка RhoA и ß-актина — для контроля нанесения.

Анализ биотинилирования поверхности клеток.

Клетки инкубировали в буфере KRPH (128 мМ NaCl, 4.7

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»