МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 1, с. 88-94
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.233.013:578.23+577.164.16(26733)
В12-НЕЗАВИСИМЫЕ ИЗОЛЯТЫ METHYLOPHAGA MARINA С ВОДОРОСЛЕЙ КРАСНОГО МОРЯ
© 2007 г. Ц. Д. Ли, Н. В. Доронина, Е. Г. Иванова, Ю. А. Троценко1
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Пущинский государственный университет Поступила в редакцию 16.02.2006 г.
С водорослей Красного моря впервые выделены В12-независимые галофильные метилобактерии (штаммы КМ3 и КМ5), использующие метанол, метиламин, диметиламин, триметиламин, диметил-сульфид и фруктозу в качестве источников углерода и энергии. Клетки - грамотрицательные подвижные палочки, монотрихи (штамм КМ3) и перитрихи (штамм КМ5). Строгие аэробы, нуждаются в ионах Na+, не зависят от ростовых факторов. Оксидазо- и каталазоположительны, нитраты восстанавливают до нитритов. Растут в интервале температур 4-37°С (оптимум 29-34°С), рН 5.5-8.5 (оптимум 7.5-8.0), содержании в среде 0.5-15% NaCl (оптимум 5-9%). В фосфолипидном составе клеток преобладают фосфатидилэтаноламин и фосфатидилглицерин, присутствуют также фосфатидилхо-лин, фосфатидилсерин и кардиолипин. Доминирующие жирные кислоты - С161ю7с и С160. Основной убихинон Q8. Накапливают в качестве внутриклеточных осмопротекторов эктоин, глутамат и сахарозу. Реализуют КДФГ-вариант рибулозомонофосфатного пути. Содержание Г+Ц в ДНК 44.4-44.7 мол. %. Анализ генов 16S рРНК выявил принадлежность штаммов КМ3 и КМ5 к Gammaproteobacteria и высокий уровень их сходства с Methylophaga marina ATCC 35842T (99.4%). На основании данных полифазной таксономии изоляты идентифицированы как новые штаммы M. marina КМ3 (ВКМ В-2386) и КМ5 (ВКМ В-2387). Способность к образованию ауксинов (индолил-3-уксусной кислоты) позволяет предполагать метаболическую связь этих штаммов с морскими водорослями.
Ключевые слова: ограниченно факультативные метилотрофы, галофилы, морские водоросли, Methylophaga marina, В12-независимые штаммы.
Высшие растения постоянно ассоциированы с аэробными метилотрофными бактериями, поскольку образуют летучие С1-соединения, а метилотрофы поставляют растениям фитогормоны (цитокинины и ауксины) и другие ростовые факторы [1]. В разных компартментах растительных клеток обнаружены интермедиаты С1-метабо-лизма: метанол (1 мкмоль/г веса сырой биомассы), формиат (0.1-1 мкмоль/г веса сырой биомассы) и формальдегид (0.1-10 мкмоль/г веса сырой биомассы), которые участвуют в биосинтезе белков, нуклеиновых кислот, пантотеновой кислоты и большого количества метилированных соединений, а также связаны со стабилизацией пектина в клеточных стенках растений. Большая часть формальдегида обратимо связана с различными клеточными нуклеофилами (глутатионом, аргинином, тетрагидрофолатом). В то же время метанол и формиат могут освобождаться из С1-мета-болизма растительных клеток и выделяться в
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: trotsenko@ibpm.push-chino.ru).
межклеточное пространство, откуда через устьица поступать в атмосферу. Метанол также может окисляться до формальдегида [2]. Эмиссия метанола растениями оценивается до 100 млн тонн в год, часть его растворяется в поверхностных слоях океана. Таким образом, мировой океан является огромным резервуаром метанола, запасы которого составляют 228 млн тонн [3]. Известно, что морские водоросли также образуют Отсоединения, однако до сих пор морские растения не анализировали на присутствие метилотрофной микрофлоры. Постоянными обитателями морской воды являются умеренно галофильные обли-гатные и ограниченно факультативные метилобактерии рода Methylophaga. Характерная особенность известных представителей этого рода -ауксотрофность по витамину В12 [4, 5]. Недавно нами выделены два штамма умеренно галофиль-ных морских метилобактерий, не зависящих от витамина В12 и других ростовых факторов.
Цель данной работы - физиолого-биохимиче-ская и таксономическая характеристика метило-трофных изолятов с водорослей Красного моря.
объекты и методы исследования
Объекты исследования и условия культивирования. Изучаемые штаммы КМ3 и КМ5 выделены с зеленых морских водорослей Ulva lactuca и Cystoseira trinodes, отобранных в разных участках прибрежных зон Красного моря (Египет, январь 2004 г). Отобранные образцы водорослей помещали в чашки Петри между листами стерильной фильтровальной бумаги. Обезвоженные таким образом водоросли использовали для инокуляции среды.
Для выделения и культивирования метилобак-терий использовали минеральную среду следующего состава (г/л): KH2PO4 - 2.0; (NH4)2SO4 - 2.0; NaCl - 60.0; MgSO4 ■ 7H2O - 0.2; FeSO4- 7H2O -0.002; pH 7.5. Накопительные и чистые культуры на среде с 1% (об/об) метанола выделяли, как описано ранее [6]. Реперным штаммом служила типовая культура метилобактерий Methylophaga marina ATCC 35842T.
Изучение культуральных и физиолого-биохи-мических свойств изолятов. При описании колоний, изучении морфологии и подвижности клеток штаммы выращивали на агаризованной среде (Difco) с 1% CH3OH (об/об). При исследовании способности изолятов восстанавливать нитраты и образовывать индолы заменяли (NH4)2SO4 в среде на KNO3. Образование индолов из Z-триптофана анализировали с реактивом Сальковского [7]. Необходимость в ионах Na+ определяли заменой натриевых солей на соли К+, Mg2+ и Li+. Галотоле-рантность изолятов определяли, выращивая культуры на жидкой среде с разным содержанием NaCl (0-20% в/об). Температурный диапазон роста оценивали на жидкой среде с 5% NaCl при инкубации в термокачалке Clim-o-Shake, "System Kuhner" (Швейцария), в интервале 0-50°С. Рост изолятов при различных значениях рН исследовали в диапазоне рН 6.0 - 12.0. Значения рН устанавливали добавлением 1 М раствора NaOH. Гидролиз крахмала, наличие оксидазы, каталазы, способность использовать метан и расти автотрофно в атмосфере Н2/O2/CO2 анализировали, как указано ранее [6]. При изучении способности изолятов использовать другие органические соединения в качестве источника углерода и энергии в минеральную среду вместо метанола вносили 0.3% (в/об) испытуемого соединения (проверяли 49 источников углерода), инокулировали культурой и инкубировали две недели на качалке при оптимальной температуре. Все летучие вещества вносили в количестве 0.5% по объему. При исследовании способности бактерий использовать различные источники азота в среду вместо (NH4)2SO4 вносили эквимо-лярные по азоту количества тестируемых ве-
ществ. При изучении потребности изолятов в витаминах в среду вносили раздельно и в смеси: тиамин, биотин, пиридоксин, рибофлавин, никотиновую кислоту, пантотеанат Са, p-аминобензоат, липое-вую кислоту, никотинамид, фолиевую кислоту, В12 - 20 мг/л или дрожжевой автолизат 0.05 % по объему. Контролем служила среда без витаминов.
Электронную микроскопию целых клеток и ультратонких срезов проводили, как описано ранее [5].
Хемотаксономический анализ. Жирнокислот-ный и фосфолипидный состав клеток штаммов определяли, как описано ранее [5]. Убихиноны экстрагировали из клеток, очищали по методу Коллинса [8] и анализировали на масс-спектрометре Finnigan MAT-8430 (Германия). Индольные соединения анализировали методами ТСХ и ВЭЖХ. Индивидуальные вещества ауксинов, полученные после ТСХ, анализировали на масс-спектрометре Finnigan МАТ 8430 MS (Германия) в стандартных условиях прямым вводом пробы при температуре испарения образца 160°С.
Качественное и количественное определение внутриклеточных осмопротекторов проводили методом протонного магнитного резонанса [9, 10], используя ЯМР-спектрометр высокого разрешения WP 80 SY ("Bruker", Швейцария). Активности ферментов определяли известными методами [11].
Выделение и анализ ДНК. ДНК выделяли и очищали по методу Мармура [12]. ГЦ состав ДНК определяли тепловой денатурацией на спектрофотометре Beckman DU-8B (США) при скорости нагрева 0.5°С в мин. В качестве стандарта использовали ДНК Escherichia coli К-12.
Ген 16S рРНК амплифицировали ПЦР, используя универсальные для 16S рДНК прокариот праймеры 27f: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 и 1492r: 5'-AAGGAAGGTGATCCAGCTCGT-3'. ПЦР-амплификацию проводили на ДНК термо-циклере "Hybaid" (Англия) в режиме: 1 цикл -95°С, 2 мин; 25 циклов - 94°С, 40 с; 60°С, 40 с; 72°С, 40 с; последний цикл - 72°С, 4 мин. Реакционная смесь (30 мкл) содержала: 10 мМ mpuc-HCl буфер; 68 мМ (NH4)2SO4; 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА); 2.5 мМ MgCl2; 5 пмоль соответствующих праймеров; 1 мкл ДНК, 0.2 мкМ каждого дНТФ и 1Е Гйд-ДНК-полимеразы. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. ПЦР-продукт гена 16S рРНК выделяли и очищали из агарозы с использованием набора Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System, согласно рекомендациям фирмы производителя ("Promega", США). Секвенирование ПЦР-фраг-мента проводили на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL ("Beckman Coulter", США), исполь-
зуя набор ферментов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing kit ("Beckman Coulter", США).
Филогенетический анализ. Предварительный филогенетический скрининг сходства нуклеотид-ных последовательностей гена 16S рРНК штаммов КМ3 и КМ5 по базе данных GenBank проводили с помощью пакета программ BLAST [http://nc-bi.nlm.nih.gov]. Для более точного определения филогенетического положения изолятов, их нуклео-тидные последовательности 16S рДНК выравнивали вручную c таковыми референтных штаммов ближайших прокариот/эубактерий с помощью программы CLUSTAL W [http:// www.genebee.msu.su/ clustal] с соответствующими последовательностями, доступными из последней версии базы данных NC-BI Database Project. Построение укорененного филогенетического дерева производили методом neighbor-joining (NEIGHBOR), реализованным в пакете программ TREECON [13]. Эволюционное расстояние рассчитывали как число замен на 100 нуклеоти-дов. Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью "bootstrap''-анализа 1000 альтернативных деревьев, используя соответствующую функцию программы TREECON. Нуклеотидные последовательности 16S рДНК штаммов КМ3 и КМ5 депонированы в GenBank под номерами DQ400507 и DQ 400508 соответственно.
РЕЗУЛБТАТЫ
Морфология. Штаммы КМ3 и КМ5 пред
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.