ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2012, том 442, № 5, с. 709-711
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 575.852
ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ НЕКОДИРУЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК ГУБОК СЕМЕЙСТВА LUBOMIRSKHDAE
© 2012 г. О. О. Майкова, Г. Н. Степнова, С. И. Беликов
Представлено академиком М.А. Грачёвым 02.08.2011 г. Поступило 03.08.2011 г.
Губки или тип РопГега — это древнейшие многоклеточные беспозвоночные животные, дивер-гировавшие от общего предка Ме1а2оа около 580—635 млн лет назад [1, 2]. Губки представляют собой многообразную, широко распространенную группу животных, играющих важную роль в водных экосистемах как биофильтраторы, а также имеющих практическое применение в фармакологии и производстве биоматериалов в качестве продуцентов вторичных метаболитов [3]. Состав и идентификация видов представляют собой первую проблему, с которой сталкиваются ученые, исследующие губок. В настоящее время систематика губок основана на морфологических признаках, таких как строение тела, особенности организации спикул и скелета [4], но эти признаки могут сильно варьироваться, в результате чего видовая идентификация губок становится затруднительной. В последние годы для решения данной проблемы применяют молекулярно-генети-ческие маркёры, особенно распространенным в этой области стал митохондриальный ген СОХ1
[5]. Однако использование этого гена, а также некоторых распространенных участков ядерного генома ограничено при видовой идентификации близкородственных видов губок. В настоящей работе приводится сравнительный анализ нуклео-тидных последовательностей некодирующих районов мтДНК губок эндемичного байкальского семейства ЬиЪотткпёае, в результате чего впервые показана их пригодность для видовой идентификации и популяционного анализа.
Семейство ЬиЬотиъкИёае обитает в озере Байкал и включает в свой состав 4 рода, 13 видов и 1 подвид, современная систематика которого также основана на морфологических признаках, главным образом на строении спикул и скелета
[6]. При этом байкальские губки обладают высокой индивидуальной и видовой морфологиче-
Лимнологический институт
Сибирского отделения Российской Академии наук,
Иркутск
Новосибирский государственный университет
ской изменчивостью. Поэтому некоторые признаки видов (а иногда и родов) перекрываются, тем самым "размывая" морфологическую границу вида, что делает их видовую идентификацию затруднительной.
Ранее было показано, что использование ряда традиционных молекулярно-генетических маркёров (18S рРНК, ITS1 и ITS2 районы рРНК и гена COX1) для видовой идентификации и филогенетической реконструкции байкальских эндемичных губок является проблематичным из-за высокой степени генетического сходства последовательностей [7—9]. Сравнительный анализ полных митохондриальных геномов губок выявил, что изменение длины мтДНК происходит в основном в результате удлинения некодирующих последовательностей, которые могут варьироваться от 2 до 24% от общего размера генома [10]. В составе межгенных областей мтДНК губок обнаружены прямые и инвертированные повторы [11, 12]. На примере книдарий, филогенетически родственной губкам группе животных, показано, что некодирующие регионы митохондриального генома могут быть успешно использованы в качестве диагностических маркёров при определении границ видов [13] и популяционном анализе [14].
С целью выявления молекулярно-генетиче-ского маркёра, пригодного для видовой идентификации близкородственных видов губок, мы исследовали внутривидовую и межвидовую изменчивость двух некодирующих регионов мтДНК байкальских губок из семейства Lubomirskiidae. В качестве таких участков нами выбраны самые протяженные районы между генами транспортных РНК: тРНКТуг - тРНК11е и тРНК11е - тРНКМй. Для сравнения с отдаленными видами мы используем полученные нами последовательности выбранного межгенного участка трех видов губок из космополитного семейства Spongillidae.
Образцы губок собраны в южной и центральной котловинах оз. Байкал во время экспедиций в 2007 и 2008 гг. с глубин 5-25 м с помощью водолазов. Образцы вида B. intermedia profundalis собраны на глубинах 550-1342 м со дна оз. Байкал с помощью батискафов "Мир-1" и "Мир-2".
710
МАЙКОВА и др.
Рис. 1. Байесовское древо, построенное на основе нуклеотидных последовательностей некодирующих районов мтДНК пресноводных губок (модель замен GTR + I + G). Звездочкой отмечены значения апостериорной вероятности >0.9.
i- L. baicalensis NC 013760
0.55
0 0.5Т
£
L. baicalensis Bs32 98
РГФ-Х baicalensis Bs186 B. intermedia Bs119 0.59
r B. intermedia Bs118
0.81
■ B. intermedia Bs123
Южная котловина, западный берег
Южная котловина, западный берег
i— L. baicalensis Bs184 L. baicalensis Bs191 L. baicalensis Bs45 L. baicalensis Bs55 L. baicalensis Bs49 L. baicalensis Bs39 - B. intermedia Bs120
L. baicalensis Bs35
0.78
Центральная котловина, район о. Ольхона
Центральная котловина, районУшканьих о-в
Центральная котловина, б. Змеевая
0.52 г L. baicalensis Bs181 L L. baicalensis Bs182
Центральная котловина, западный берег
0.721- B. intermedia Bs121 L. baicalensis Bs29
0.59
0.63
. L. sp. Bs124 ,— B. martinsoni Bs60
0.68
B. martinsoni Bs69 ■ L. fusifera Bs126
. S. papyrasea Bs28
— L. incrustance Bs129
0.78
* r B. bacillifera Bs61
гЧ
0.62
B. martinsoni Bs128 B. bacillifera Bs30
B. martinsoni Bs77
0.55
B. intermedia profundalis Bs58 B. intermedia profundalis Bs85 B. intermedia profundalis Bs78 B. intermedia profundalis Bs89
_j— E. fluviatilis TKh2"
_^"L*E. fluviatilis Dzh06, I— E. fluviatilis GU 057847
Центральная котловина, между м. Ухан и Ежемей
Центральная котловина, м. Ухан
Тува
■ E. muelleri NC_010202 - E. muelleri Bs11
0.06
* г S. lacustris Bs7
■ S. lacustris Bs57
*
*
Из 13 описанных Ефремовой [6] эндемичных видов губок в нашей работе мы исследуем только 8 в связи с малочисленностью и трудоемкостью добывания недостающих видов. Выделение суммарной ДНК проводили путем лизиса ткани в SDS-буфере в присутствии протеиназы К. Амплификацию и секвенирование фрагментов проводили с использованием специфических прай-меров, сконструированных на консервативные последовательности генов тРНК: (1;гпУ-1;гпМ_Ь) 5' - ОАТООСАОАОСООТААТОС- 3', (ИпМ-trnY_R) 5'-ОТАООТТСОАОТССТОССТ-3'. Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли с помощью программ МАББТ у. 6.240 и ИОЕ^ (http://ugene.unipro.ru/ index.html), при этом для дистанционного и филогенетического анализов из выравненных последовательностей были удалены уникальные де-леции/вставки. Построение филогенетического
древа на основе нуклеотидных последовательностей проводили байесовским методом посредством программы MrBayes v. 3.1.2. Данные о генетических расстояниях получали при помощи программы MEGA 4.0.
Нами определены нуклеотидные последовательности фрагмента митохондриального генома, включающего два высоко вариабельных участка между генами тРНКТуг и тРНКмы, разделенные геном тРНКш. Из 36 полученных последовательностей 31 принадлежит байкальским эндемичным губкам (Lubomirskiidae, 8 видов) и 5 — к кос-мополитным губкам (Spongillidae, 3 вида). Последовательности депонированы в базу данных GenBank под номерами GU980930-GU980944, JF267505—JF267516, GU057847-GU057856. Для сравнения в филогенетический и сравнительный анализы были включены 3 опубликованные ранее
ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ НЕКОДИРУЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
711
последовательности видов L. baicalensis (NC_013760), E. fluviatilis (GU_057847) и E. muelleri (NC_010202). Длина амплифицированных последовательностей варьировалась от 400 п.н. у E. fluviatilis (Spongillidae) до 1000 п.н. у L. fusifera (Lubomir-skiidae), что связано с присутствием множественных делеций/вставок у байкальских губок.
Максимальные попарные генетические расстояния (p-distance) наблюдаются между последовательностями губок, принадлежащих к разным семействам, и варьируются от 0.117 до 0.211, среднее расстояние внутри Spongillidae составляет 0.12, в то время как внутри семейства Lubomir-skiidae это значение в 2.8 раз меньше (0.043). Из табл. 1 видно, что для представителей семейства Spongillidae внутривидовые генетические дистанции меньше, чем межвидовые, в то время как для семейства Lubomirskiidae эти значения перекрываются.
На филогенетическом древе (рис. 1) все исследованные губки формируют две отдельные группы, соответствующие семействам Lubomirskiidae и Spongillidae. Представители одинаковых видов из семейства Spongillidae объединены в отдельные кластеры с высокими значениями апостериорных вероятностей (>0.9). Внутри семейства Lubomirskiidae виды L. baicalensis и B. intermedia profundalis формируют отдельные хорошо разрешенные (>0.9) кластеры. Распределение образцов L. baicalensis на три клады соответствует трем разным географическим ареалам. В первую кладу входят губки из районов пос. Листвянки и пос. Большие Коты (Южная котловина, западный берег). Во вторую кладу входят образцы из Центральной части Байкала, внутри которой наблюдается еще подразделение (район о. Ольхон и район Ушканьих о-в). Третью группу формируют два образца L. baicalensis из района западного побережья Центральной котловины. На основе анализа межгенных районов мтДНК вид B. intermedia наиболее близок виду L. baicalensis, с которым он формирует общий кластер на филогенетическом древе, несмотря на то, что по морфологии эти виды отнесены к разным родам [6]. Также стоит отметить, что виды B. bacillifera и B. martinsoni формируют общую группу на филогенетическом древе. То, что два глубоководных экземпляра B. martinsoni (Bs60 и Bs69) объединены в один кластер с S. papyracea и L. fusifera, можно объяснить недостатком образцов данных видов.
Таким образом, в результате проведенных исследований выявлено, что некодирующие последовательности митохондриального генома губок могут
Таблица 1. Генетические расстояния, подсчитанные на основе нуклеотидных последовательностей двух межгенных районов мтДНК
Spongillidae Lubomirskiidae
внутривидовые генетические расстояния межвидовые генетические расстояния внутривидовые генетические расстояния
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.