= МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК [57+61]::539.1.04:599.9
ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ПРОСТЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОВТОРОВ
В ДНК КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ МУЖЧИН, ПОДВЕРГШИХСЯ ПРОЛОНГИРОВАННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ
© 2013 г. М. Г. Ломаева1*, Л. В. Малахова1, М. Л. Захарова2, С. Н. Соколова2, Л. А. Фоменко1, В. Н. Антипова1, И. Ю. Соболева1, В. Г. Безлепкин1, Е. Н. Кириллова2, А. И. Газиев1
1 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино 2 Южно-Уральский институт биофизики ФМБА, Озёрск,
В отдаленные сроки после облучения изучали изменение уровня полиморфизма микросателлит-ас-социированных повторов ДНК периферической крови (ПК) у мужчин — работников ПО "Маяк" (г. Озёрск), подвергавшихся в период профессиональной деятельности внешнему пролонгированному воздействию у-радиации. Образцы ДНК были получены из Радиобиологического репозитория тканей человека ЮУрИБФ ФМБА и использованы при проведении ПЦР со "случайно выбранным праймером" (АР-РСЯ). При анализе полученных наборов амплифицированных фрагментов ДНК было обнаружено статистически достоверное увеличение количества высокомолекулярных и уменьшение числа низкомолекулярных фрагментов ДНК из ПК лиц, подвергшихся облучению в диапазоне доз от 0.01 до 5.5 Гр суммарно, по сравнению с группой индивидов, не имевших контакта с источниками радиации. Не обнаружено пропорциональной зависимости изменения величин показателя полиморфизма ДНК от накопленной суммарной дозы у-радиации. Таким образом, регистрация величины показателя полиморфизма микросателлит-ассоциированных повторов выявляет повышение вариабельности общей клеточной ДНК ПК мужчин, подвергшихся пролонгированному воздействию у-излучения при значительной неравномерности скорости накопления дозы. Отсутствие линейной зависимости эффекта от накопленной дозы не позволяет использовать анализированный параметр для ретроспективной оценки суммарной дозовой нагрузки.
Работники ПО "Маяк", пролонгированное у-облучение, полиморфизм МКС-ассоциированных повторов. БОТ: 10.7868/80869803113010062
Изучение результатов медико-биологического обследования работников предприятий ядерной промышленности, подвергшихся в период профессиональной деятельности пролонгированному воздействию ионизирующей радиации (ИР), в отдаленном периоде после облучения предоставляет уникальную возможность для прояснения феноменологии отдаленных последствий радиационного воздействия на человека. Сопоставление таких данных с изменениями, происходящими на субклеточном и молекулярном уровнях, позволяет расширить современные представления о генетических механизмах формирования пострадиационных нарушений. В последнее время для выявления разнообразных нарушений в ДНК внимание исследователей привлекают простые нуклеотидные повторы, характеризующиеся высокой природной вариабельностью. К ним от-
* Адресат для корреспонденции: 142290 Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН; тел.: (4967) 7393-46; e-mail: lommg@rambler.ru.
носятся мини- и микросателлитные (МКС) повторы последовательностей нуклеотидов в ДНК, а также МКС-ассоциированные повторы, широко представленные в геноме млекопитающих и человека [1, 2]. Полагают, что оценка показателей, характеризующих частоту полиморфных МКС-повторов, как спонтанную, так и индуцированную действием излучения, является адекватным способом регистрации общей изменчивости или нестабильности генома (НСГ) [2, 3]. Ранее использование нами технологии ПЦР со "случайно выбранным" праймером (АР-РСЯ) позволило обнаружить повышение соматической и трансгенерационной НСГ у мышей после острого воздействия ИР в диапазоне доз от 0.5 до 2 Гр [4-6].
В настоящей работе представлены итоги изучения величины показателя полиморфизма длин МКС-ассоциированных повторов в ДНК клеток периферической крови (ПК) работников ПО "Маяк" (г. Озёрск), подвергавшихся воздействию ИР в период профессиональной деятельности,
как проявления индуцированной генетической изменчивости в соматических клетках в отдаленные сроки после облучения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Обследованные лица и препараты ДНК. В исследованиях использовали препараты ДНК из ПК мужчин — работников ПО "Маяк" (115 человек сходного возраста), подвергшихся пролонгированному внешнему воздействию у-радиации на производстве. В "контрольной группе" (45 человек) были использованы препараты ДНК из ПК, предоставленные мужчинами — работниками ПО "Маяк", не имевшими профессиональных контактов с источниками ИР. Очищенные препараты ДНК были получены из Радиобиологического репозитория тканей человека (РРТЧ) ЮжноУральского института биофизики ФМБА (г. Озёрск) [7, 8]. Особенностью пролонгированного радиационного воздействия на профессионалов в условиях производственной деятельности является высокая степень его неравномерности по дозе и по времени. Поэтому в нашей работе при оценке отдаленных последствий воздействия ИР на профессионалов как референтный параметр рассматривается величина суммарной дозо-вой нагрузки (СДН). В зависимости от величины СДН доноры, подвергшиеся облучению, были разделены на пять групп по следующим дозовым диапазонам: 0.01-0.5 Гр; 0.51-1.0 Гр; 1.01-2.0 Гр; 2.01-3.0 Гр и 3.01-5.5 Гр. Кроме величины СДН и длительности воздействия ИР, значительно различалась длительность временного интервала между окончанием контакта с источниками ИР и моментом взятия крови у донора на исследование или в хранилище. Минимум составлял 7 лет, а максимум - 52 года. Однако у подавляющего количества доноров длительность периода времени, прошедшего между окончанием воздействия ИР и моментом взятия образца крови, в основном, была 18-27 лет. Для оценки полиморфизма длин амплифицированных фрагментов образцы ДНК мужчин из группы с временным интервалом между окончанием воздействия ИР и моментом взятия крови меньше 18 и больше 27 лет не использовались. Календарный возраст мужчин, подвергшихся воздействию ИР и не имевших контактов с источниками ИР, приблизительно совпадал. Возрастная разница была не более 6-10 лет.
Полимеразная цепная реакция. Для проведения AP-PCR из многих предварительно тестированных "случайно выбранных" праймеров [5] были выбраны три олигонуклеотида, дающих стабильно воспроизводимые результаты:
(5' - TCTGAAGACAGCTACAGTGT- 3'), (5'-AAAGGCGAGGACTTTGTCAA-3') [9], а также (5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3') [10]. Прай-меры, именуемые в дальнейшем соответственно
Atp-1, Mor+1 и TELO-1. были синтезированы ЗАО "Синтол" (Москва), имели температуры отжига 40, 45 и 42°С. Для повышения стабильности условий AP-PCR и получения воспроизводимых наборов продуктов амплификации во всех экспериментах использовали процедуру "горячего старта" и реагенты одной и той же компании ("Fermentas, UAB"). Анализируемые на электро-фореграммах после разделения в 7%-ном полиа-криламидном геле диапазоны длин продуктов AP-PCR, амплифицированных с каждым из праймеров, выбирали с учетом локализации в них участков с наибольшим количеством полиморфных фрагментов ДНК. При использовании прай-мера Atp-1 анализировали фрагменты ДНК с длинами в диапазоне от 2540 до 460 пар нуклеотидов (п.н.), Mor+1 - от 3680 до 430 п.н. и TELO-1 - от 3400 до 680 п.н. соответственно. Определение размеров анализируемых фрагментов ДНК проводилось посредством аппроксимации (с точностью до 10 п.н.) к размерам маркерных фрагментов с помощью программы оценки молекулярной массы PHOTO-CAPT из комплекта оборудования "Фотодокументирующая система DP-001, FDC" (Vilber Luormat). В качестве маркеров были использованы: FastRuler™ DNA Ladder, Middle Range (100-5000 bp); фХ 174 DNA/BsuRI (HaeIII) (72-1353 bp), Marker 9; O'GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder (100-1000 bp) ("Fermentas, UAB").
Визуализация и анализ ДНК-фингерпринтов. Амплифицированные фрагменты после электро-форетического разделения окрашивали азотнокислым серебром, упаковывали в целлофан, высушивали и сканировали, как описано ранее [5]. ДНК-фингерпринты имели вид сложного набора (спектра) полос от желтого до темно-коричневого цвета на фоне прозрачного геля. Изменение цвета было обусловлено количеством материала в полосе и не позволяет проводить оценку полиморфизма по количеству продуктов AP-PCR в полосах посредством фотометрии гелей. По этой причине для количественной оценки полиморфизма МКС-ассоциированных последовательностей ДНК использовали подход, основанный на определении размеров (расчет в п.н.) амплифициро-ванных олигонуклеотидов. Для сравнительного анализа характера распределения амплифициро-ванных фрагментов был специально разработан (в среде Delphi, язык Object Pascal) программный продукт "GelAnalyser", работающий под управлением операционных систем Windows 97, 98 и Windows XP [11].
Статистическая обработка. Достоверность различий средних величин определяли по ¿-критерию Стьюдента с использованием Statistica 6.0 (StartSoft Inc., США). Вычисление значений от-
носительных нормированных изменений полиморфизма по формуле
А = ((Аобл - АКонтр)/Аср) х 100%,
где Аср = (Аобл + Аконтр)/2 [6] проводилось для минимизации возможного влияния на расчеты незначительных вариаций в условиях проведения отдельных серий экспериментов. При этом Аконтр и Аобл — величины показателей полиморфизма длин амплифицированных фрагментов ДНК крови (фактически - доли полиморфных полос) в группах контрольных и подвергшихся пролонгированному воздействию ИР мужчин соответственно.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Предварительно нами был проведен ряд экспериментов для обнаружения связи выявленного уровня значений показателя полиморфизма длин амплифицированных фрагментов и продолжительности времени, прошедшего с момента окончания воздействия ИР на организм, до получения образцов ПК. Анализ полученных результатов не выявил существенных отличий значений показателя полиморфизма для препаратов ДНК, где временной промежуток прекращения контактов с излучением был от 7 до 52 лет. Для этого сравнивали препараты ДНК, полученные от индивидуумов с близкими по величине СДН (данные не приведены). Можно предположить, что одной из причин получения подобных результатов является продолжительность жизни в кровяном русле ядросодержащих клеток. Даже самые долгоживу-щие клетки заме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.