ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 6, с. 876-884
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ СОСТАВА ТКАНЕСПЕЦИФИЧНОГО ГАЛАКТАНА ВОЛОКОН ЛЬНА
© 2007 г. Т. Е. Чернова*, О. П. Гурьянов*, Н. Б. Брач**, А. В. Павлов**, Е. А. Пороховинова**, С. Н. Кутузова**, С. Б. Чемикосова*, Т. А. Горшкова*
*Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук, Казань **Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. НИ. Вавилова, Санкт-Петербург
Поступила в редакцию 27.03.2007 г.
У 23 различных генотипов льна культурного (Ьтыш ш'НМг^ччтит L.) анализировали тканеспецифич-ный галактан волокон склеренхимы, формирующих клеточную стенку желатинозного типа. Оценены содержание и средняя степень полимеризации боковых цепочек галактана до закрепления этого полисахарида в клеточной стенке. Проанализированные характеристики тканеспецифичного галактана волокон льна отличаются высокой вариабельностью; размах паратипической изменчивости между повторностями и годами изучения внутри одного генотипа сопоставим с различиями между отдельными генотипами. Средняя длина боковых цепочек у исследованных образцов варьировала от 5 до 41 остатка галактозы. Выявлена дискретность значений средней степени полимеризации боковых цепочек галактана волокон льна, что можно объяснить блочностью сборки полимера в аппарате Гольджи.
Ключевые слова: Ьтыш usitatissimum - растительные волокна - желатинозные волокна - клеточная стенка - полисахариды - галактан -рамногалактуронан I- качество льноволокна.
ВВЕДЕНИЕ
Вторичные клеточные стенки различных тканей растений неодинаковы по составу и структуре. По таким признакам, как расположение микрофибрилл целлюлозы, степень и характер лигни-фикации, доминирующий компонент нецеллюлозного матрикса, можно выделить два типа вторичных клеточных стенок [1]. Хорошо известна вторичная клеточная стенка первого, ксиланово-го, типа, которая присутствует, например, у большинства клеток ксилемы и характеризуется спиральным расположением микрофибрилл целлюлозы, доминированием ксилана в нецеллюлозном матриксе и высоким содержанием лигнина. Значительно менее изучена клеточная стенка второго, желатинозного, типа, отличающаяся слабой лиг-нификацией, аксиальным расположением микрофибрилл целлюлозы и особым характером биогенеза, в котором ключевую роль играют галактозо-содержащие полисахариды. Клеточная стенка второго типа характерна для желатинозных волокон, к числу которых относят флоэмные волокна лубоволокнистых культур, таких как лен и конопля, а также волокна древесины напряжения.
Адрес для корреспонденции: Горшкова Татьяна Анатольевна. 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31, а/я 30. Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН. Электронная почта: gorshkova@mail.knc.ru
На стадии утолщения клеточной стенки желатинозные волокна синтезируют особый ткане- и стадиеспецифичный высокомолекулярный полисахарид [1]. Подробно охарактеризован тканеспе-цифичный полисахарид волокон льна [2, 3]. Его обнаруживают в стебле растущих растений ниже так называемой "точки слома", которая служит маркером перехода в развитии волокон от интрузивного роста к утолщению клеточной стенки [4]. Структура этого полисахарида проанализирована с помощью метилирования [2], а также методами ЯМР и времяпролетной масс-спектрометрией в сочетании с лазерной десорбцией (MALDI-TOF MS) фрагментов, полученных в результате химического и ферментативного гидролиза полимера [3, 5]. Тканеспецифичный галактан льна представляет собой рамногалактуронан I с высокой степенью ветвления остатков рамнозы (более 90%) и с боковыми цепочками из в-1,4-галактозы, которые составляют основную массу полимера и определяют его название. Длина отдельных боковых цепочек может достигать нескольких десятков остатков галактозы [3].
Распределение тканеспецифичного галактана волокон в клетке было показано иммуноцитохи-мически с использованием специфичного к в-1,4-галактозным остаткам моноклонального антитела LM 5 [1, 6]. Это антитело окрашивает вторичную клеточную стенку, а также пузырьки аппарата Гольджи, которые в большом количестве концен-
трируются в цитоплазме волокон, приступивших к формированию вторичной клеточной стенки [6]. При гомогенизации ткани не встроившийся в клеточную стенку галактан попадает в буфер и, благодаря значительной молекулярной массе (9002000 кД), может быть отделен от других полимеров с помощью гель-фильтрации. Это дает редкую возможность охарактеризовать индивидуальный полисахарид до встраивания в клеточную стенку, не прибегая к методам сильных воздействий (обработка кислотой, щелочью или ферментами), которые обычно требуются для выделения полимеров, уже встроенных в клеточную стенку, и могут модифицировать их структуру.
Существуют единичные работы по биохимической характеристике полисахаридов до встраивания в клеточную стенку; анализу подвергали полимеры либо в изолированных структурах аппарата Гольджи [7, 8], либо в буфере для гомогенизации ткани [9-11]. Из-за сложности выделения или низкого содержания полимеров в этих фракциях, не проведено системных работ по выявлению вариабельности состава индивидуальных полисахаридов до встраивания в клеточную стенку. Между тем оценка такой вариабельности, если она существует, могла бы позволить выявить особенности сборки полимеров в аппарате Гольджи, а также служить основой для понимания характера постсинтетических модификаций, происходящих в ходе формирования надмолекулярной структуры клеточной стенки и ее последующих изменений. Анализ ткане- и стадиеспецифичного галактана волокон льна дает возможность охарактеризовать индивидуальный полисахарид клеточной стенки, формирующийся в стебле целых растений, рассматривая его и как пример полисахарида клеточной стенки в целом, и как ключевой полимер мат-рикса клеточной стенки желатинозного типа. Еще один интересный аспект изучения вариабельности тканеспецифичного галактана волокон в различных генотипах льна связан с поиском корреляций этих параметров с показателями качества льноволокна. Поэтому целью данной работы была оценка содержания и состава тканеспецифичного галактана волокон в различных образцах льна и сопоставление этих характеристик с показателями качества льноволокна.
МЕТОДИКА
Для анализа использовали 23 различных генотипа льна из коллекции Всероссийского института растениеводства им Н.И. Вавилова (ВИР), в число которых входили селекционные сорта и доноры хозяйственно ценных признаков льна-долгунца, а также инбредные линии, включавшие как долгунцы, так и межеумки (табл. 1). Растения были выращены на полях Пушкинского филиала ВИР (Ленинградская обл.) на делянках площадью
1 м2 с густотой стояния, соответствовавшей производственным посевам. Работу проводили в течение 2004 и 2005 гг., различавшихся по погодным условиям и набору выращиваемых генотипов; 11 форм было изучено в течение двух лет. Для ряда генотипов в один год брали пробы с двух различных делянок рандомизированного посева. Ранневесенняя засуха 2004 г. вызвала неравномерность появления всходов. В табл. 1 отмечены образцы, взошедшие быстро, и те, которые имели задержку появления всходов. Общее количество проанализированных образцов составило 56.
Растительный материал для анализа тканеспецифичного галактана фиксировали в период быстрого роста льна (35-45 дней после посева). Участок стебля (5 или 10 см) ниже "точки слома", которая служит маркером начала формирования вторичной клеточной стенки волокон [12], разделяли на внутреннюю (ксилемную) и наружную части. Для анализа использовали содержавшую волокна наружную часть стебля, в которую входят также эпидермис и паренхима. Растительную ткань (0.6-1.2 г) гомогенизировали в 10 мл 50 мM К-фосфатного буфера (pH 7.0). Затем гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при 8000 g. Содержавшиеся в супернатанте буферорастворимые полимеры осаждали 96%-ным этанолом в соотношении супернатант : этанол 1 : 5 (до конечной концентрации этанола 80%), трижды промывали им и высушивали. Полученные образцы растворяли в 0.01 М Na-ацетатном буфере (pH 4.5) и центрифугировали в течение 10 мин при 10000 g; супернатант наносили на хроматографическую колонку. Для выделения тканеспецифичного галактана волокон использовали колонку (12 х 400 мм) Сефарозы 4B ("Pharmacia", Швеция), позволяющую разделить полисахариды в диапазоне мол. м. от 30 до 5000 кД. Элюцию проводили 0.01 М Na-ацетатным буфером (рН 4.5) со скоростью 0.25 мл/мин. В качестве детектора использовали дифференциальный рефрактометр Knauer (Германия). Объем отбираемых фракций был 1 мл.
Фракции, содержавшие высокомолекулярный галактан (900-2000 кД), объединяли, концентрировали в токе азота, обессоливали на колонке PD Сефадекс G-25M (20 х 80 мм) и высушивали в токе азота при температуре 60°С. Затем фракции гидролизовали 2 М трифторуксусной кислотой при 120°С в течение 1 ч и сушили в токе азота при температуре 40°С. Моносахаридный состав анализировали высокоэффективной анионообмен-ной хроматографией (система DX 500, "Dionex", США), на колонке CarboPac PA 1 (4 х 250 мм, "Dionex"), используя пульс-амперометрический детектор (PAD ED 40, "Dionex"). Скорость элюиро-вания 1 мл/мин. Температура колонки 30°С. Буферы: А - 0.015 M NaOH; B - 1 M NaAc, 0.1 М NaOH. Линейный градиент: 0-20 мин A - 100%; 20-21 мин А - 90%, В - 10%; 21-31 мин А - 70%,
Список генотипов льна, использованных для анализа, и нумерация образцов
Код генотипа в коллекции Нумерация образцов
Наименование генотипа 2004 г., ранние всходы 2004 г., поздние всходы 2005 г.
Долгунцы
гк1 л-1 из к-30, сел. Альтгаузена, Россия 1; 2
гк2 л-1 из к-48, сел. Альтгаузена, Россия 3 4 5; 6
гк13 л-5 из к-489, Архангельская губ., Россия 7 8; 9
гк65 л-3 из к-3178, Тверская губ., Россия 10; 11
гк109 л-3-2 из к-6099, Mokovi M.A.G., Аргентина 12 13
гк124 л-1 из к-6284, Stormont Motley, Сев. Ирландия 14 15 16; 17
гк143 л-1 из к-6917, c (47-4) 80, Versailles, Франция INRA 18; 19
гк260 ВИР-103, донор скороспелости 20
гк271 ВИР-104, донор скороспелости 21
к5333 Светоч, Россия, ВНИИЛ 22 23 24; 25
к6815 К-6, Росс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.