МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 5, с. 868-875
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 616.988:576.858
ВАРИАНТЫ АДЕНОВИРУСА ТИПА 5 С ДЕЛЕЦИЯМИ В РАННИХ ГЕНАХ: СПОСОБНОСТЬ К СЕЛЕКТИВНОЙ РЕПЛИКАЦИИ В р53-ДЕФЕКТНЫХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА
© 2003 г. А. В. Качко*, В. А. Святченко, В. А. Терновой, H. Н. Киселев, А. В. Сорокин,
С. Л. Киселев1, Г. П. Георгиев1, С. В. Нетесов
Научно-исследовательский институт молекулярной биологии, Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Кольцово, Новосибирская обл., 630559 1Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, 117984 Поступила в редакцию 14.02.2003 г.
С использованием сайт-направленного мутагенеза сконструированы варианты аденовируса человека серотипа 5, дефектные по генам Е1А и Е1В. Аденовирус Adel3 с мутацией в гене E1A имеет высокую степень аттенуации для пермиссивных культур клеток независимо от статуса р53 и способен эффективно реплицироваться только на комплементарной клеточной культуре 293. Вариант Adel2 с делецией в гене E1B55K инфицирует комплементарные клетки 293 и р53-дефектные опухолевые клетки человека (A431, SW480 и HEp2) с эффективностью аденовируса дикого типа, тогда как его репликация существенно ограничена в нормальных р53-позитивных клетках. Таким образом, Adel2 обладает способностью селективно инфицировать и лизировать р53-дефектные опухолевые клетки человека in vitro. Введение Adel2 в привитые бестимусным мышам nu/nu опухоли приводит к выраженному подавлению роста этих опухолей (эпидермоидная карцинома человека А431). Полученные результаты свидетельствуют о перспективности Adel2 для разработки средств терапии злокачественных новообразований человека с поврежденным р53.
Ключевые слова: аденовирус, сайт-направленный мутагенез, E1B55K, р53-дефектные опухолевые клетки, селективная онколитическая активность.
Опухолевый ген-супрессор р53 - один из основных факторов, препятствующих размножению патологических клеток в организме. В ответ на различные повреждения, грозящие появлением наследуемых изменений в геноме (мутагенные воздействия, активация онкогенов, гипоксия и т.д.), происходит активация р53, в результате которой клетка либо прекращает делиться, либо вступает в апоптоз [1]. Тот факт, что мутации в гене р53 наиболее часто приводят к размножению опухолевых клеток человека [2], обусловил проведение многочисленных исследований, направленных на поиск эффективных подходов к терапии опухолей с повреждением р53. Следует отметить, что ген р53 активируется и при заражении клеток вирусами. Однако некоторые ДНК-содержащие вирусы, такие как аденовирусы, 8У40 и папилломавирус человека, кодируют бел-
Принятые сокращения: Лё5 - аденовирус человека серотипа 5; Лёе12 - мутант аденовируса серотипа 5 с делецией 2309-3427 п.н. в гене Е1В55К; Лёе13 - мутант аденовируса серотипа 5 с делецией 908-1426 п.н. в гене Е1А; ТЦПД50 -50%-ная тканевая цитопатогенная доза; Е1А, Е1В - ранние гены аденовируса серотипа 5.
* Эл. почта: kachko@vector.nsc.ru
ки, которые инактивируют р53 и тем самым позволяют вирусам реплицироваться в клетке [3, 4]. У аденовирусов за данную функцию ответственны ранние гены [1], необходимые для эффективной репликации аденовирусов в нормальных клетках человека. Однако в клетках, лишенных активности р53, аденовирусы с дефектами в генах, продукты экспрессии которых связывают и инактивируют клеточный р53, по-видимому, должны сохранять способность к эффективному размножению. Таким образом, существует возможность создания мутантных аденовирусов, избирательно размножающихся в р53-дефектных клетках. Следует отметить, что опухоли, в клетках которых поврежден ген р53, составляют более 50% всех злокачественных опухолей человека и обладают повышенной устойчивостью к хи-мио- и радиотерапии [5-7].
Цель настоящей работы - конструирование с помощью сайт-направленного мутагенеза вариантов Лё5 с мутациями в генах Е1А и Е1В и изучение их способности избирательно инфицировать и лизировать р53-дефектные опухолевые клетки человека.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Клеточные культуры и вирусы. Клетки 293, HEp2, SW480 и A431 культивировали как моно-слойные культуры на среде DMEM ("Gibco BRL", Германия), содержащей 10% плодной сыворотки крупного рогатого скота ("Gibco BRL", Германия) и 80 мкг/мл гентамицина сульфата. Нормальные первичные фибробласты кожи человека и кожи эмбриона человека (HSF и HSEF соответственно) приготовлены и культивированы в НИИ клеточных культур, ГНЦ ВБ "Вектор" согласно [8].
Ad5 дикого типа, полученный из Государственной коллекции вирусных штаммов при Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, и сконструированные нами мутанты Ad5 - Adel2 (делеция 2309-3427 п.н. в гене E1B55K) и Adel3 (делеция 908-1426 п.н. в гене Е1А) нарабатывали на полусливной монослойной культуре клеток 293 (клетки эмбриональной почки человека, трансформированные генами E1A и E1B Ad5). При достижении 70%-ного цитопатогенного воздействия вируса на клеточную культуру клетки концентрировали центрифугированием (1500 g, 5 мин). Гомо-генат инфицированных клеток экстрагировали равным объемом фтористого углерода ("Arklone PICI Ltd"), после чего водную фракцию, содержащую вирус, центрифугировали в градиенте плотности хлористого цезия (1.45-1.33 г/мл, 2 ч при 90000 g). Для отделения вируса от клеточных компонентов проводили дополнительную очистку на преформированном градиенте плотности хлористого цезия (1.45-1.33 г/мл, 6 ч при 100000 g). Фракцию, содержащую вирус, отбирали, разводили в соотношении 1 : 4 буфером Трис-EDTA. Вирус осаждали с помощью высокоскоростного центрифугирования, после чего осадок ресуспендировали в 3 мл буфера Трис-EDTA (5 мМ Трис-HCl, 1 мМ EDTA, рН 7.8). Вирусную ДНК выделяли из препаратов очищенных аденовирусов согласно [9].
Плазмиды, несущие вставки фрагментов генома Ad5 с делециями в генах Е1А и Е1В, конструировали с помощью стандартных генно-инженерных методов [10]. Использовали препараты ферментов рестрикции и модификации производства ТОО "СибЭнзим" (Новосибирск, Россия). Плазмиды секвенировали с использованием T7-Seque-nase version 2.0 DNA sequencing kit ("Amersham Life Science, Inc.", США).
Рекомбинантные плазмиды и аденовирусную ДНК трансфицировали в клеточную линию 293 с помощью кальций-фосфатного метода. Полученные с помощью гомологичной рекомбинации му-тантные варианты аденовируса отбирали с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Нуклеотидные последовательности участков аденовирусного генома с направленно внесенны-
ми мутациями определяли по методу Сэнгера с использованием T7-Sequenase version 2.0 DNA sequencing kit ("Amersham Life Science, Inc.", США).
Цитолитическую активность мутантных Ad5 и вируса дикого типа изучали на панели р53-дефектных опухолевых и нормальных клеток человека с помощью микрометода [11] на 96-луноч-ных культуральных планшетах ("Costar", США). Инфекционный титр вирусов для клеток данного типа выражали через ТЦПД50 (50%-ная тканевая цитопатогенная доза). Для определения реплика-тивных свойств вирусов нормальные фибробласты и р53-дефектные опухолевые клетки человека инфицировали Adel2, Adel3 или аденовирусом дикого типа с множественностью 1 ТЦПД50/кл. Через 48 ч после инфицирования вирус выделяли из клеток посредством трехкратного замораживания-оттаивания. Полученные после центрифугирования супернатанты титровали на клетках 293. Количества Adel2 и Adel3 нормализовали по отношению к количеству Ad5 дикого типа, продуцируемого в той же клеточной линии за тот же период времени.
Противоопухолевую активность Adel2 in vivo изучали на 8-недельных бестимусных мышах nu/nu (Онкологический научный центр РАМН, Москва), прошедших двухнедельный карантин и содержавшихся в асептических условиях. Животным подкожно (в боковую поверхность) вводили 1.0 х 107 опухолевых клеток A431 в 0.2 мл cреды DMEM. Объем опухолей определяли по следующей формуле: (максимальная длина) х (максимальная ширина)2/2. Опухоли, достигшие объема 40-60 мкл инокулировали Adel2. С этой целью в каждую опухоль в течение 5 дней ежедневно вводили по 109 ТЦПД50 вируса в 20 мкл среды DMEM. В контрольные опухоли (привитые контрольным животным) инъецировали по той же схеме инакти-вированный ультрафиолетовым излучением Adel2.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Конструирование плазмид, несущих фрагменты
генома Ad5 с делециями в генах Е1А и Е1В
Схемы конструирования мутантных Ad5 c делециями в генах E1B и Е1А представлены на рис. 1а и рис. 2a. Для получения плазмид с делециями в нужных районах генов использовали специфические праймеры 600-610, рассчитанные по нук-леотидной последовательности Ad5 (GenBank N^010960) с помощью программы Oligo 3.0 (табл. 1).
Продукт ПЦР-амплификации 603/609 длиной 1827 п.н. был встроен в плазмиду pRS-2 по EcoRI-Sa/I-сайтам. Затем в плазмиду по Sa/I-BamHI-сай-там встроили ПЦР-продукт 610/608 длиной 1157 п.н. и получили плазмиду pAd5. На следующем этапе в плазмиду pAd5 ввели продукт ампли-
600 601 603
\ \ / 609 6
\ \/ Е1А6К ЕШХОК / Е1В55К /
610
>
/ 608
ПЦР-продукт 600/601
ПЦР продукт 603/609 Делеция ПЦР-продукт 610/608 ................................................. 2309-3427 п.н. I
ЕсоМ
рА(15Е1Вде1, содержащая 5'-область ДНК Аё5 (3505 п.н.)
I
Гомологическая рекомбинация между Аё5 ДНК-С1аI и плазмидой рА(15Е1ВсМ-ЕсоЫ
1 2 3 4 5 6 М п.н. п.н.
4000
2600 :2000
■ 1350 . 970
■ 750
710
570 550
404
Рис. 1. Конструирование мутанта Аёе12 аденовируса типа 5 с делецией в гене Е1В55К. а - Схема конструирования плаз-миды рАё5Е1Вёе1, несущей фрагмент 3505 п.н. 5'-области генома Аё5 с делецией в гене Е1В55К. б - ПЦР-анализ ДНК Аёе12. В качестве матрицы использовали: ДНК Аё5 (1-3), ДНК мутанта Аёе12 (4), ДНК контрольных клеток (5), плаз-мидную ДНК рАё5Е1Вёе1 (6), М - маркер (плазмида рМС5, обработанная эндонуклеазой рестрикции Mspl).
фикации 600/601 длиной 503 п.н., в результате чего получили плазмиду рАё5Е1Вёе1. Правильность конечной конструкции подтверждали рестрикцион-ным картированием и секвенированием. Плазмида рАё5Е1Вёе1 содержит 3505 п.н. 5'-области
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.