МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 2, с. 211-217
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.864.017:575.117.2
ВЕКТОР pLF22 ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЯХ
© 2004 г. Б. В. Тараканов*1, А. А. Яковлева**, Т. А. Николичева*, Н. М. Комкова*, А. И. Манухина*, В. В. Алёшин***
*ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных РАСХН, г. Боровск
**НИИ физико-химической биологии им. А Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва Поступила в редакцию 22.04.03 г.
Сконструирован плазмидный вектор для экспрессии. Вектор содержит репликон криптической плазмиды pLF1311 из Lactobacillus fermentum и множественный сайт клонирования в составе lacZ', интегрированный в rep оперон плазмиды, что обеспечивает обязательную конститутивную транскрипцию клонированных последовательностей, лишенных терминаторов транскрипции, во всех штаммах, поддерживающих репликацию вектора. Потенциальные штаммы-хозяева включают широкий круг грамположительных бактерий и грамотрицательные бактерии, в том числе пробиоти-ческие штаммы. Эффективность векторной системы была проверена на экспрессии в-галактозида-зы в лабораторном штамме Escherichia coli и синтетического гена пептидного гормона - рилизинг фактора соматотопного гормона в пробиотических штаммах лактобацилл и энтерококков. Реком-бинантная культура с геном рилизинг фактора соматотопного гормона оказывала влияние на физиологические, гистолого-анатомические показатели и рост лабораторных животных, получавших пробиотический штамм с кормом.
Ключевые слова: оцДНК плазмиды, грамположительные бактерии, пробиотики, соматолиберин.
Молочнокислые бактерии (лактобациллы, лактококки, энтерококки) - обширная группа грамположительных бактерий, играющая важную роль в природе и, кроме того, важный объект биотехнологии. Уже разработано немало плазмидных векторных систем для клонирования и экспрессии генов в этих микроорганизмах [1-6], однако их технологичность уступает таковой векторов бацилл или кишечных палочек. Во многих случаях успешной гетерологичной экспрессии в клетках лактобацилл транскрипция чужеродных генов осуществлялась с их природных промоторов [5] или требовала специального клонирования и селекции промоторных последовательностей для клеток реципиентного штамма [4]. Ранее была показана возможность включения в состав репликативного оперона плазмид посторонних последовательностей без нарушения функции репликации [7, 8]. Целью настоящего исследования было конструирование вектора, гарантированно обеспечивающего транскрипцию клонированной последовательности в широком круге молочнокислых и других бактерий за счет активности промотора репликативных генов.
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: bifip@kaluga.ru).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Плазмиды и бактериальные штаммы. В работе использовали различные производные криптической плазмиды pLF1311 из Lactobacillus fermentum ВКМ 1311 [3], векторы pUK21 и pTZ19R, плазмиду pGRF1 [9], плазмиду pJEL24, несущую ген lacZ без инициаторного кодона (получена от А.С. Миронова, ГНИИгенетика) и плазмиду pUKTZ, которая представляет собой модифицированную pUK21, полученную заменой малого PvuII фрагмента на таковой плазмиды pTZ19R. Для создания селективных условий на агаризова-ных средах использовали хлорамфеникол ("Sigma") в концентрации 15 мкг/мл. В жидкой среде клетки E. coli, содержащие плазмиду, выращивали при концентрации хлорамфеникола не более 5 мкг/мл. ДНК выделяли из культуры в поздней стационарной фазе, после 18-24 ч роста. Более подробно условия культивирования описаны ранее [3]. В качестве грамположительных реципиентов использовали молочнокислые бактерии Lactobacillus acidophilus K3, Lactobacillus sp. 8РАЗ, Enterococcus faecalis OG1 из лабораторной коллекции и штамм Enterococcus faecium М74 - компонент пробиотика "Энтерацид П". Все штаммы являются непатогенными обителями кишечника.
211
5*
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для
амплификации последовательности соматолибе-рина и соединения ее с сигналом инициации трансляции использовали олигонуклеотидные затравки MI - d(GAAGGATAAATTTATGTACGCT-GACGCTATCT), включающую потенциальный SD участок, инициаторный триплет и разделяющий их AT-богатый спейсер, и MII - d(TCCATATTG-GTCGACTATTAA). Амплификацию осуществляли в следующем режиме: 93°С - 1 мин, 50°С - 1 мин, 72°С - 1 мин, всего 25 циклов. Продукт нужного размера очищали электрофорезом в 4%-ой легкоплавкой агарозе и после фосфорилирования клонировали по сайту EcoRV в вектор pBlue-scriptKS+ ("Stratagene").
Клонирование ДНК. Молекулярное клонирование и анализ рекомбинантных клонов E. coli осуществляли по общеизвестным методикам. Эн-донуклеазы рестрикции, ДНК лигаза фага Т4 и другие ферменты нуклеинового обмена получены от "СибЭнзим" (Новосибирск) или "MBI Fermentas" (Литва).
Активность ß-галактозидазы определяли колориметрически с о-нитрофенол^-О-галактози-дом (ОНФГ) в качестве субстрата [10].
Содержание лабораторных животных. Для проведения опыта из 1,5-месячных помесных кроликов пород калифорнийская х советская шиншилла было сформировано несколько группы, в каждой по 3 самца и 4 самки. Крольчата были размещены в сетчатых клетках по 1-2 головы. Первая группа получала основной рацион (ОР), животные остальных групп ежедневно в смеси с кормом дополнительно получали по 1 мл культур исходного или рекомби-нантного штамма с титром около 4 х 109 КОЕ (ко-лониеобразующих единиц). Группы, получающие культуры исходного штамма, служили контролем для групп, получавших соответствующий реком-бинантный штамм. Продолжительность опыта варьировала от 2 до 4 мес.
Гистологические и ультраструктурные исследования проводили по методике, более подробно описанной ранее [11]. Супраоптические ядра гипоталамуса исследовали на серийных срезах. Функциональное состояние нейроцитов оценивали по количеству гомориположительного вещества. Площадь ядер и тел нейронов измеряли с помощью окуляр-микрометра. Митотический коэффициент в аденогипофизе определяли как число митозов в 500 клетках. Ультратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе ЭМ 100 К. Цифровой материал обрабатывали с использованием критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Введение lacZa в состав repAB оперона
Векторы на основе репликона pLF1311 [3] сохраняют организацию природной плазмиды, относящейся к семейству рЕ194-подобных плазмид. Их репликация зависит от экспрессии генов rep-оперона. Первый из генов оперона кодирует белок RepA - негативный регулятор транскрипции, а второй ген кодирует белок RepB, инициирующий репликацию по механизму катящегося кольца, начинающуюся с сайта плазмидной ДНК ori+ [12]. Транскрипция указанных генов осуществляется с единого промотора. Поскольку белок RepB строго необходим для репликации, указанный промотор функционирует во всех штаммах, в которых отмечена репликация плазмиды. Включение в состав оперона дополнительной последовательности обеспечит, таким образом, ее транскрипцию во всех потенциальных хозяевах, круг которых для репликона pLF1311 весьма широк [3].
В плазмиде pLF1311 гены repA и repB разделены спейсером 76 п.н., который содержит сайты для эндонуклеаз рестрикции HindIII и HaeII. Конструирование экспрессионного вектора включало несколько этапов, которые привели к получению плазмиды pLF22, в которой соответствующий спейсер замещен (после затупления липкого конца HindIII) на участок BsrBI-HaeII плазмиды pUKTZ, несущий беспромоторный lacZa, ориентированный в том же направлении, что и гены репликативного оперона. Поскольку сайт BsrBI находится внутри оператора lac оперона, клонированный фрагмент lacZa не подвержен действию lac-репрессора. Экспрессия lacZa обеспечивает комплементацию в штамме E. coli TG1 (pLF22), колонии которого окрашены в синий цвет на чашках с хлорамфениколом и Xgal независимо от присутствия в среде индуктора lac оперона ИПТГ.
2. Экспрессия клонированного в pLF22 гена в кишечных палочках
Окрашивание колоний кишечных палочек TG1(pLF22) на чашках с Xgal свидетельствует о постулированной транскрипции repA + lacZa + repB мРНК с промотора репликативных генов плазмиды и синтезе a-пептида. Для оценки эффективности репликативного промотора для экспрессии последовательностей в кишечных палочках мы клонировали беспромоторную последовательность ß-галактозидазы, которая была извлечена из плазмиды pJEL24 в виде полноразмерной рамки lacZ без стартового кодона и лигирована с ДНК вектора pLF22, гидролизованной по сайтам BamHI и Acc16I. Полученная плазмида pLF23 кодирует слитный белок ß-галактозидазы (рис. 1а) и обеспечивает высокий уровень его экспрессии в
(a)
BamHI
Г"
lacZ
DraI/Acc16I
pJEL1246
SD SD
SD SD
hö bfe
repA lacZ ' 'lacZ
repB
pLF22
у. ед
(6) 300
200
1 2
100
p
rep
4
3
Рис. 1. Структура слитного гена lacZ и его экспрессия, обусловленная плазмидой pLF23: а - структура клонированного в pLF23 гена lacZ; б - активность Р-галактозидазы по результатам ферментации в пробирках в зависимости от времени ферментации и присутствия индуктора lac оперона ИПТГ; условные единицы активности (у. ед.) вычислены по [10]: 1,3 - рост в отсутствие ИПТГ, 2, 4 - в присутствие ИПТГ; 1,2 - начало экспоненциального роста; 3,4 - середина экспоненциального роста.
Lac- штаммах, который был идентифицирован по активности фермента в отношении ОНФГ как субстрата и который не зависел от присутствия в среде индуктора lac оперона (рис. 16). Отмеченная максимальная активность ß-галактозидазы составляла примерно треть от наблюдаемой в Lac+ штаммах в условиях полной активации lac промотора [10]. Наиболее активно экспрессия происходила на стадии экспоненциального роста культуры, когда можно ожидать наибольшей активности работы репликативных генов плазми-ды. В стационарной стадии, когда активной репликации плазмиды не происходит, наблюдалось падение активности ß-галактозидазы (рис. 16).
3. Экспрессия в молочнокислых реципиентах
Экспрессию клонированных последовательностей в грамположительных реципиентах проверяли на другой тест-системе. Для этого исследовали воздействи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.