ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 543.544.5:543.42:543.51
ВЭЖХ АНТОЦИАНОВ С АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТОРОМ: ОЦЕНКА АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ
© 2015 г. Л. А. Дейнека*, С. Л. Макаревич*, В. И. Дейнека*' 1, А. Н. Чулков**
*Белгородский государственный национальный исследовательский университет, биолого-химический факультет
308015 Белгород, ул. Победы, 85
1Е-таИ: deineka@bsu.edu.ru
**Белгородский филиал "Центр оценки качества зерна и продуктов его переработки"
308027Белгород, ул. Щорса, 8
Поступила в редакцию 20.03.2014 г., после доработки 10.06.2014 г.
Методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с диодно-матричным, масс-спектрометрическим и амперо-метрическим детекторами исследованы комплексы антоцианов ряда сортов винограда с традиционным для Vitis уШ/ега составом, содержащие в качестве основных компонентов 3-глюкозиды пяти антоцианидинов — дельфинидина (Бр3О), цианидина (Су3О), петунидина (Р13О), пеонидина (Рп3О) и мальвидина (Му3О). Разработана методика определения антиоксидантной активности индивидуальных антоцианов амперометрическим методом, выявлены особенности использования прибора Цвет Яуза-01-АА. Показано, что чувствительность амперометрического детектирования зависит не только от строения антоцианов, но и от напряжения на аноде. Предложена схема расчета антиоксидантной активности антоциановых комплексов по результатам амперометрического детектирования смеси индивидуальных антоцианов.
Ключевые слова: антоцианы, Vitis уШ/ега, антиоксидантная активность, амперометрический метод, Цвет Яуза-01-АА.
БО1: 10.7868/80044450215080083
Антиоксидантную активность (АОА) в настоящее время рассматривают как свойство, во многом определяющее биологическую активность растительного сырья и получаемой из него продукции [1]. Особая роль винограда в этом отношении связана с так называемым "французским парадоксом" [2], который объясняется высокой АОА красных виноградных вин. Несмотря на то, что в плодах винограда синтезируется большое число веществ, обладающих АОА [2], основной вклад в нее в случае соков и вин красных сортов винограда приходится на антоцианы [3]. Хорошо известно, что различные сорта винограда могут иметь различный видовой набор антоцианов, построенных на пяти основных агликонах [4, 5]. При этом для плодов растений вида Vitis уш/ега основу антоциановых комплексов составляют 3-глюкозиды (схема) дельфинидина, петунидина и мальвидина (Эр3О, Р13О и Му3О — антоцианы дельфиниди-нового ряда), цианидина и пеонидина (Су3О и Рп3О — антоцианы цианидинового ряда), а вклад
производных пеларгонидина (Р§3О) обычно минимален. Известно также, что АОА зависит от строения антоцианов [6, 7], поэтому видовой состав антоцианового комплекса для более полной оценки лечебно-профилактических свойств винограда желательно дополнить количественной информацией по АОА.
В настоящее время предложено большое число различных методов определения АОА [8], но, к сожалению, физическому смыслу получаемых при этом параметров не всегда уделяют должное внимание [9]. В связи с этим результаты, полученные с использованием различных методов, не всегда коррелируют между собой [10]. В НПО "Химавтоматика" разработан простой, быстрый и доступный амперо-метрический метод определения суммарного содержания антиоксидантов (по терминологии [9] — относительной АОА), потенциальные возможности которого до конца еще не выяснены [11].
OH O OH
IV III
Строение и некоторые переходы между формами антоцианов в кислых средах. Формы: I — флавилиевая, II — полуацетальная (псевдооснование), III — цис-халконная, IV — транс--халконная.
Цель настоящей работы — определение видового состава антоцианов плодов некоторых сортов винограда, выращенных в белгородской области, и оценка АОА индивидуальных компонентов амперометрическим методом.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Винограды различных сортов получены в сезоне 2012 г. с виноградников Крыма (Украина), а в 2013 г. — из частных садов Белгорода. Антоцианы экстрагировали из отделенной от плодов кожицы настаиванием в 0.1 М водном растворе HCl. Экстракт отделяли от остатка фильтрованием через бумажный фильтр и очищали твердофазной экстракцией на концентрирующих патронах ДИАПАК С18 (БиоХимМак СТ, Москва).
Очищенные образцы разделяли на фракции индивидуальных антоцианов на хроматографе Shi-madzu c использованием колонки (250 х 10 мм) SUPELCOSILTMLC-18 (5 мкм) с элюентом, содержащим 10 об. % муравьиной кислоты и 10 об. % ацетонитрила в воде, со спектрофотометрическим детектированием при 515 нм. Пеларгонидин-3-глюкозид выделяли из плодов земляники садовой аналогичным методом.
В работе использовали хроматографическую систему Agilent 1200 Infinity с двумя детекторами — диодно-матричным и масс-спектрометрическим. Антоцианы разделяли на колонке (250 х 4.6 мм) Symmetry C18 (5 мкм) с диодно-матричным детектором. Для записи полной хроматограммы использовали градиентное элюирование элюентами А (10 об. % муравьиной кислоты и 6 об. % ацетонитрила в воде) и Б (10 об. % муравьиной кислоты и 24 об. % ацетонитрила в воде). Программа градиента: 0 мин - 0% Б, 10 мин - 0% А, 14 мин - 90% Б, 20 мин - 100% Б, 21 мин - 0% Б, 27 мин - 0% Б. По-
скольку электронные спектры чувствительны к концентрации органической добавки в растворе, контроль антоцианов по электронным спектрам в градиентном режиме ненадежен. Для контроля электронных спектров регистрировали хроматограммы индивидуальных 3-глюкозидов и их смеси в изократическом режиме с подвижной фазой, содержащей 10 об. % муравьиной кислоты и 10 об. % ацетонитрила в воде. Во всех случаях расход подвижной фазы составлял 1 мл/мин.
Для записи масс-спектров использовали микроколонку (150 х 2.1 мм) Кгоша811 100-5С18 и изо-кратический режим с подвижной фазой 10 об. % муравьиной кислоты и 10 об. % ацетонитрила в воде при расходе 0.150 мл/мин. Исследуемые антоцианы идентифицировали по электронным и масс-спектрам (табл. 1).
АОА определяли на приборе Цвет Яуза-01-АА (НПО "Химавтоматика", Москва) со стеклоугле-родным электродом. В качестве начальной подвижной фазы использовали раствор ортофос-форной кислоты 150 мкл/л (рН ~ 2.8) в дистиллированной воде (расход 1.2 мл/мин).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Определение антоцианов плодов (точнее — кожицы плодов) винограда в условиях обращенно-фазовой хроматографии в общем случае требует градиентного элюирования, хотя для винограда вида УНя уМ/вга обычные составляющие экстрактов ЭрЗО, СуЗО, Pt3G, РпЗО и музо, элюи-рующиеся в указанном порядке, могут быть разделены и в изократических условиях. К этому набору антоцианов обычно добавляются еще несколько групп производных: 1) имеющие существенно более сильное удерживание перечисленные 3-глюко-зиды, ацилированные уксусной кислотой по поло-
Таблица 1. Строение и свойства антоцианов, исследованных в работе
Антоциан Rз. К* Vax, нм* т/г
Дельфинидин-3-глюкозид, Бр3О ОН ОН 524 303.0; 465.1
Петунидин-3-глюкозид, Р13О ОСН3 ОН 525 317.1; 479.1
Мальвидин-3-глюкозид, Му3О ОСН3 ОСН3 526 331.1; 493.2
Цианидин-3-глюкозид, Су3О ОН Н 515 287.0; 449.1
Пеонидин-3-глюкозид, Рп3О ОСН3 Н 515 301.1; 463.1
Пеларгонидин-3-глюкозид, Р§3О Н Н 502 271.1; 433.1
* Подвижная фаза, содержащая 10 об. % НСООН и 8 об. % ацетонитрила в воде.
жению 6''; 2) еще более липофильные антоцианы, ацилированные (также по положению 6'') транс-ку-маровой кислотой [12] (рис. 1). Хроматографиче-ская картина может быть усложнена примесями 3-глюкозидов, ацилированных кофейной и другими кислотами. Наконец, в настоящей работе не будем рассматривать винограды гибридных сортов, отличающиеся присутствием в 3,5-диглюко-зидах тех же антоцианидинов.
На рис. 1 представлены хроматограммы экстрактов кожицы плодов трех сортов винограда с заметно различающимися составами, а в табл. 2 — параметры АОА ряда типичных для V. уш/ега сортов, выращенных в условиях Белгорода и в Крыму, с уровнем накопления 3,5-диглюкозидов не выше 1%. Различия между некоторыми сортами оказались весьма за-
метными. Так, у винограда сорта Страшенский антоциановый комплекс образован в основном антоцианами дельфинидинового ряда с очень высокой степенью метилирования. Напротив, анто-цианы плодов сорта Рошфор относятся к циани-диновым с высокой степенью метилирования, а сорт Гала занимает промежуточное положение — при очень высокой степени метилирования антоцианы обоих рядов содержатся в сопоставимых количествах. Исследованные образцы различаются также степенью ацилирования (ацилированные антоцианы имеют времена удерживания более 9 мин). Для виноградов одинакового сорта, но из разных регионов видны некоторые различия в количественном составе антоциановых комплексов,
шЛи
2000
1750 1500 1250 1000 750 500 250
■ 4 •<а) 1 2 3 , 5 _^_^
"(б)
л ^ л
11111111
10
12
14
16
мин
Рис. 1. Разделение антоцианов кожицы плодов винограда трех сортов Страшенский (а), Гала (б) и Рошфор (в) в градиентом режиме: 1 - Бр3О1и, 2 - Су3О1и, 3 - Р13О1и, 4 - Рп3О1и, 5 - Му3О1и.
0
6
0
2
4
8
Таблица 2. Содержание (%) антоцианов в плодах некоторых сортов винограда
Сорт винограда (цвет плодов) Бр3О Су3О Pt3G Рп3О Му3О Ац ЕАОАр
Украина, Крым (Судак, Новый свет), 2012 г.
Мускат гамбургский (темно-синий) 6.0 4.8 27.4 0 57.3 4.4 94.9
Магарач (темно-синий) 17.2 2.3 14.7 5.3 50.5 9.9 91.0
Кодрянка (темно-синий) 6.6 1.5 8.9 14.0 62.0 7.3 101.7
Страшенский (темно-синий) 3.3 0.4 4.8 8.4 64.1 18.9 90.9
Ризомат (красный) 8.6 6.5 7.6 25.7 46.9 4.8 104.0
Память Негруля (темно-синий) 9.2 7.3 7.5 25.7 31.9 18.4 87.8
Кардинал (фиолетово-красный) 1.1 3.8 0.4 63.8 28.1 2.8 114.7
Белгород, 2013 г.
Кодрянка (темно-синий) 5.5 1.6 6.2 17.4 54.5 14.7 94.5
Таврия (темно-синий) 2.1 0.6 3.4 12.3 49.8 31.2 77.2
Агат Донской (темно-синий) 10.1 2.5 9.3 10.9 47.4 19.7 85.1
Гала (темно-синий) 1.7 1.1 2.5 32.6 45.6 16.5 96.5
Страшенский (темно-синий) 4.1 0.8 4.7 11.4 44.3 34.7 72.5
Черная магия (темно-синий) 13.2 2.6 13.3 10.1 42.6 18.1 83.8
Кубань (темно-синий) 13.9 2.7 13.9 8.2 41.4 19.7 81.2
Ришелье (темно-синий) 5.1 2.8 5.9 29.8 40.8 14.9 94.3
Кардинал (фиолетово-красный) 0.4 5.1 0.5 76.4 9.0 8.0 108.6
Рошфор (фиолетово-красный) 0.8
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.