ОБЩАЯ ГЕНЕТИКА
УДК 575.1:595.773.4
ВИДОСПЕЦИФИЧНОСТЬ ЛОКАЛИЗАЦИИ ДНК ИЗ ПРИЦЕНТРОМЕРНОГО ГЕТЕРОХРОМАТИНА НА ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМАХ В КЛЕТКАХ СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗ И В 3D-ОРГАНИЗАЦИИ ЯДЕР ТРОФОЦИТОВ У Drosophila virilis И Drosophila kanekoi
(Díptera: Drosophilidae) © 2014 г. К. Е. Усов1, И. Э. Вассерлауф2, Г. М. Абылкасымова3, В. Н. Стегний1
1Томский государственный университет, Биологический институт, кафедра цитологии и генетики, Томск 634050 e-mail: usovke@rambler.ru 2Научно-исследовательский институт биологии и биофизики национального исследовательского Томского государственного университета, Томск 634050 3Институт общей генетики и цитологии Национальной академии наук Республики Казахстан, Алматы 050060, Казахстан Поступила в редакцию 20.02.2014 г.
Была проведена микродиссекция хромоцентра политенных хромосом слюнных желез D. virilis и получена район-специфичная ДНК-библиотека (DvirlII). С помощью метода FISH проведена гибридизация DvirlII с политенными хромосомами слюнных желез и трофоцитов D. virilis и D. kanekoi. Установлена локализация DvirIII в прицентромерных районах хромосом и в прителомерном районе хромосомы 5 у обоих видов, а также выявлена видовая специфичность в локализации последовательностей ДНК DvirIII по некоторым районам хромосом. С целью изучения трехмерной организации районов прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом трофоцитов D. virilis и D. kanekoi проведена 3D FISH DvirIII с хромосомами трофоцитов этих видов. В результате выявлена видовая специфичность в распределении сигналов DvirIII в пространстве ядра. Так, у D. virilis сигнал был обнаружен в локальном хромоцентре на одном полюсе ядра, а на другом полюсе выявлялся сигнал, принадлежащий теломерному району хромосомы 5, в то время как у D. kanekoi сигналы DvirIII в пространстве ядра занимают две обособленные области. Одна из них принадлежит при-центромерному району хромосомы 2, а другая — прицентромерным районам остальных хромосом.
DOI: 10.7868/S0016675814110150
Изучение разных аспектов проблемы пространственной организации хромосом и их отдельных районов в интерфазном ядре является актуальным направлением генетики. Современное положение о том, что хромосомы занимают в интерфазном ядре эукариот определенные территории, установлено для клеток животных [1, 2], растений [3], а также одноклеточных, таких как почкующиеся и делящиеся дрожжи [4]. Таким образом, было установлено, что на протяжении всего клеточного цикла хроматин строго упорядочен, и хромосомы сохраняют свою территориальность в пространстве ядра, что необходимо для экспрессии генов, сегрегации хромосом [5—8]. Пространственная организация и функциональность ядра обеспечиваются наличием двух типов связей — хромосомно-мембранных и межхромосомных взаимодействий. За последние несколько лет, в результате интенсивного изучения архитектуры ядра, стало достоверно известно, что ядерная оболочка является основой пространственной координации и регуляции морфологии и ди-
намики хромосом. В результате специфического взаимодействия хромосом с ядерной оболочкой обеспечивается их пространственная укладка в не перекрывающиеся хромосомные территории [1, 9, 10]. На биохимическом уровне пространственная упорядоченность хроматина выражается в виде специфического связывания особых некодирую-щих последовательностей ДНК гетерохроматина с различными ядерными белковыми структурами, такими как ядерный матрикс и ядерная ламина [11—13]. Предполагается, что в нативном ядре эти последовательности ДНК, "заякоренные" белками различных структур, являются основой пространственной упорядоченности хроматина. Таким образом, понимание принципов расположения генетического материала в пространстве интерфазного ядра имеет особое значение, так как оно во многом определяет его активность и его транскрипционный статус [14]. Следует отметить, что исследование архитектуры ядра необходимо проводить путем поиска зависимости пространственной реорганизации хромосом от изме-
нения последовательностей, находящихся в гетерохроматических районах хромосом. В связи с этим большой интерес представляет исследование процессов реорганизации гетерохроматина, способных повлиять на архитектуру хромосомного аппарата. Особое значение при этом имеет исследование архитектуры ядер клеток генеративной системы (трофоциты яичников). Поскольку было показано, что именно в клетках генеративной системы, в отличие от клеток соматической системы, архитектура ядра является видоспеци-фичной и в процессе видообразования происходит реорганизация хромосом в пространстве ядра [15, 16]. Известная эволюционная лабильность на молекулярном и цитогенетическом уровнях гете-рохроматина [17—20] до сих пор не оценена по отношению ключевого феномена эволюции — видообразования. Кроме самых общих представлений, чаще умозрительных гипотез, отсутствуют данные о роли гетерохроматина в организации хромосом и особенно в пространственной их организации в интерфазном ядре. Необходимо подчеркнуть, что изучение пространственной организации интерфазного ядра и закономерностей ее изменения является актуальным для понимания процесса видообразования и особенностей функционирования генома. Удобным объектом для решения обозначенных проблем являются ядра с политенными хромосомами видов Droso-phila группы virilis. Известно, что клеточные ядра с политенными хромосомами являются хорошей моделью интерфазного ядра. Виды D. virilis (фи-лада virilis) и D. kanekoi (филада montana) являются стволовыми в филогенетических схемах группы virilis [21, 22]. У этих видов в ядрах трофоцитов существует хромоцентральная организация хромосом — локальный хромоцентр у D. virilis (при-центромерные районы хромосом тесно объединены между собой крупным гетерохроматиновым блоком) и диффузный хромоцентр у D. kanekoi (прицентромерные районы хромосом рассредоточены в пространстве ядра и объединены тонкими хроматиновыми тяжами). Политенные хромосомы трофоцитов видов филады virilis имеют локальный хромоцентр. В то же время виды филады montana имеют три морфотипа организации хромосом в ядрах трофоцитов — диффузный хромо-центр, хромосомы рассредоточены в пространстве ядра и хромосомы прицентромерными районами контактируют с оболочкой ядра [23, 24]. Ранее нами было показано, что эволюционные преобразования в пространственной организации ядер трофоцитов дрозофил происходили от видов с локальным хромоцентром к видам с диффузным хромоцентром и к видам, у которых хромоцентр не выявляется и хромосомы рассредоточены в пространстве ядра [23, 24]. По-видимому, такие эволюционные преобразования организации хромосом в ядре связаны с изменением об-
щего количества гетерохроматина в хромосомах и с его перераспределением по плечам хромосом, которое происходило в ходе видообразования. Сравнительный анализ состава ДНК и пространственной организации районов прицентромер-ного гетерохроматина политенных хромосом трофоцитов D. virilis и D. kanekoi позволит выявить особенности и изменения трехмерной организации хромосом, связанные с эволюционными преобразованиями кариотипов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследований служили клетки слюнных желез личинок 4-го возраста и питающие клетки яичников самок D. virilis и D. kanekoi, которые имели возраст 3—4 сут после вылупления из пупария.
Суховоздушные препараты политенных хромосом питающих клеток яичников и слюнных желез D. virilis и D. kanekoi были приготовлены по стандартному протоколу [25].
Микродиссекция хромоцентра D. virilis и амплификация ДНК хромоцентра. Микродиссекция хромоцентра политенных хромосом клеток слюнных желез D. virilis была проведена на инвертированном микроскопе Axiovert 200 (Carl Zeiss, Германия) с микроманипуляторами MN-4 "Narishige" (Япония) по модифицированной для политенных хромосом методике [26, 27].
На покровном стекле 60 х 24 мм был приготовлен суховоздушный препарат политенных хромосом. Затем хромоцентр соскабливали силикони-зированной стеклянной иглой, управляемой микроманипулятором "Narishige".
Все дальнейшие этапы приготовления район-специфичной ДНК-библиотеки хромоцентра политенных хромосом клеток слюнных желез D. virilis проводили согласно протоколу [26, 27]. Размер фрагментов ДНК-библиотеки (DvirIII) варьировал приблизительно от 250 до 750 пн.
Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). Все этапы FISH проводили согласно стандартному протоколу [28]. Хромосомы окрашивали флуоресцентным красителем DAPI, растворенным в антиокислительном агенте Vfectashield. Анализ и регистрацию результатов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа AxioImager Z1 (Carl Zeiss, Германия), CCD камеры AxioCam и программного обеспечения AxioVision Rel. 4.5.
В результате проведения FISH было проанализировано не менее 40 ядер трофоцитов D. virilis и D. kanekoi.
3D флуоресцентная in situ гибридизация (3D FISH)
Фиксация ткани. 1. Материал (яичники D. virilis и D. kanekoi) выделяли в 1х PBS (Phosphate
ВИДОСПЕЦИФИЧНОСТЬ ЛОКАЛИЗАЦИИ ДНК
1301
Buffered Saline, фосфатный буфер) и переносили в 1.5-мл микроцентрифужную пробирку на льду. Были выделены яичники из 14 самок D. virilis и D. kanekoi.
2. Яичники фиксировали в 4%-ном парафор-мальдегиде в PBT (0.1% Tween 20 в 1х PBS) 20 мин при комнатной температуре.
Этапы прегибридизации, гибридизации и по-стгибридизационной отмывки были проведены согласно протоколу [29].
Приготовление и анализ препаратов. Материал помещали на предметное стекло в камеру, заполненную DAPI-Vectashield. В приготовленном подобным образом препарате не происходит деформации клеток, что позволяет проводить микроскопию интактных ядер. Анализ и регистрацию результатов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа AxioImager Z1 с аппаратным модулем ApoTome (Carl Zeiss, Германия), позволяющим получать оптические срезы с лучшим разрешением даже на толстых образцах, CCD камеры AxioCam и программного обеспечения AxioVision Rel. 4.5 (Carl Zeiss, Германия). В результате был проведен анализ трехмерной организации районов прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом в 47 ядрах трофоцитов D. virilis и в 50 ядрах трофоцитов D. kanekoi.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.