МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 3, с. 344-350
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.844.9
ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ МАГНИТОТАКТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ РЕКИ ОЛЬХОВКА
© 2013 г. М. В. Дзюба*, Т. В. Колганова*, В. М. Горленко**, Б. Б. Кузнецов*
*Центр "Биоинженерия"РАН, Москва **Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва Поступила в редакцию 25.06.2012 г.
Методом магнитной сепарации из образцов воды и ила р. Ольховка (г. Кисловодск) была получена фракция магнитотактических бактерий, из тотальной ДНК которой с помощью ПЦР и дальнейшего клонирования получена библиотека клонов фрагментов генов 16S рРНК. В результате филогенетического анализа 67 последовательностей случайно выбранных клонов было показано, что магни-тотактические бактерии представлены в библиотеке двумя филотипами, один из которых включает 42 последовательности, другой — всего одну последовательность. Остальные 24 последовательности принадлежали немагнитотактическим бактериям. Филогенетический анализ показал, что оба фи-лотипа относились к магнитотактическим коккам, причем последовательности, представленные в библиотеке наибольшим числом клонов, практически полностью идентичны последовательности гена 16S рРНК пресноводного кокка TB24 (X81185.1), идентифицированного ранее среди магнитотактических бактерий озера Чимси (Бавария). Филотип, представленный единственной последовательностью, образует на дендрограмме отдельную ветвь, а его последовательность сходна с TB24 на 97%. Обнаруженные филотипы, вместе с последовательностями некультивируемых пресноводных магнитных кокков, формируют отдельную ветвь внутри класса Alphaproteobacteria и, предположительно, представляют собой отдельное семейство внутри сформированного недавно порядка Mag-netococcales. Несмотря на то, что при анализе библиотеки клонов фрагментов генов 16S рРНК, фи-лотипы, принадлежащие магнитотактическим спириллам, не были обнаружены, после вторичного обогащения фракции магнитотактических бактерий с использованием метода "race track" был выделен новый штамм магнитотактических спирилл Magnetospirillum SO-1. Наиболее родственной штамму SO-1 является описанная ранее магнитотактическая спирилла Magnetospirillum magneticum AMB-1.
Ключевые слова: магнитотактические бактерии, магнетосомы, магнитотаксис, 16S рРНК, филогенетический анализ.
DOI: 10.7868/S0026365613030038
Способность магнитотактических бактерий (МТБ) к активному движению вдоль силовых линий внешнего магнитного поля — магнитотак-сису — обусловлена наличием внутриклеточных магнитных включений (магнетосом). Магнето -сомы представляют собой однодоменные кристаллы магнетита (Fe3O4) или грейгита (Fe3S4), заключенные в мембранные везикулы [1, 2]. Эта уникальная группа микроорганизмов представляет интерес для широкого круга специалистов. Во-первых, МТБ обладают большим биотехнологическим потенциалом благодаря способности к синтезу магнитных наноразмерных частиц высокого качества, которые приобретают все большее значение для различных видов диагностики, анализа, а также создания материалов но-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: dzyubamv@ gmail.com).
вого поколения [3]. Во-вторых, тот факт, что МТБ способны накапливать железо в количестве более 3% от сухого веса, а также их широкая представленность в водных экосистемах, указывают на существенный вклад этой группы бактерий в биогеохимический цикл железа [2].
Микроскопические исследования МТБ, обнаруженных в различных природных экосистемах, выявили большое морфологическое разнообразие — среди них встречаются кокки, спириллы, палочки, вибрионы, а также многоклеточные формы [4]. Кроме того, МТБ являются филогенетически гетерогенной группой. Наиболее изучены на настоящий момент магнитотактические бактерии, относящиеся к филе Рго1еоЬас1епа, классу Л1рНарго1еоЬас1егча, семейству Rhodospirillace-ае. Некоторые представители данного семейства выделены в чистые культуры: Ма^еОртИыт mag-
netotacticum, M. magneticum, M. gryphiswaldense [5, 6]. Кроме того, в составе Alphaproteobacteria недавно был сформирован новый порядок Magnetococcales и в нем семейство Magnetococcaceae, включающее культивируемые магнитные кокки Magnetococcus marinus MC-1 и штамм MO-1 [7]. В чистые культуры из Alphaproteobacteria выделены также морские магнитотактические вибрионы MV-1 [8]. В классе Deltaproteobacteria в чистые культуры были выделены два вида — Desulfovibrio magneticus, способный к синтезу магнетосом, содержащих магнетит, а недавно был изолирован штамм BW-1, способный к синтезу грейгита (Fe3S4) [9, 10]. Однако, в целом, культивирование МТБ продолжает оставаться сложной задачей. Несмотря на более чем 30 лет исследований этой группы микроорганизмов, в чистую культуру выделено лишь небольшое количество видов. Тем не менее, магнитотак-тические бактерии, благодаря их способности к магнитотаксису, могут быть легко сконцентрированы из образцов воды и ила природных водоемов с помощью магнита. Поэтому, в настоящий момент, изучение их разнообразия в большей степени основано на молекулярно-генетических методах исследования, чем на классических микробиологических методах, включающих получение чистых культур и культивирование [11]. В различных работах с помощью анализа последовательностей генов 16S рРНК было показано значительное филогенетическое разнообразие МТБ и выявлены не только представители этой группы, относящиеся к Alpha- и Deltaproteobacteria, но также принадлежащие к классу Gammaproteobacteria и филуму Nitrospi-rae [12-14].
Несмотря на наличие многочисленных доказательств широкого распространения МТБ в пресноводных и морских водных местах обитания и высокую потенциальную ценность МТБ для практического использования, количество исследований, посвященных анализу разнообразия этих бактерий в водоемах Российской Федерации, продолжает оставаться невысоким. Согласно литературным данным, они обитают в природных, химически стратифицированных водоемах. Наибольшее разнообразие наблюдается в олиго- и мезотрофных водоемах, в то время как в эвтрофных МТБ отсутствуют, или их разнообразие невелико. Выбранный для настоящего исследования водоем - р. Ольховка, расположенный в черте города Кисловодск (Ставропольский край), удовлетворял всем перечисленным условиям.
Таким образом, настоящая работа посвящена изучению видового разнообразия МТБ пресного водоема, реки Ольховка, как с применением современных молекулярно-генетических методов, так и классического микробиологического подхода.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Формирование микрокосма. Пробы были взяты из прибрежного донного осадка реки Ольховка с глубины около 0.5 м в черте города Кисловодск (Ставропольский край, N 43°56'07'', E 42°41'25''), в феврале. Ил и вода в соотношении 1 : 4 по объему были использованы для формирования микрокосма (общий объем 3 л), который затем инкубировали в стеклянных аквариумах в течение нескольких недель в темноте, при комнатной температуре.
Выделение клеток МТБ методом магнитной сепарации. Выделение клеток МТБ проводили аналогично методике, описанной ранее [15]. Магнит (1 Тл) помещали с внешней стороны стенки аквариума, на границе раздела фаз ил/вода. Образовавшееся через 1—3 ч у северного полюса магнита пятно с биомассой магнитотактических бактерий отбирали с помощью пипетки Пастера.
Для более полного отделения МТБ от бактерий, не обладающих способностью к магнитотак-сису, использовали метод магнитного обогащения в капилляре ("race track") [15].
Световая и просвечивающая электронная микроскопия. Морфологию клеток исследовали под световым микроскопом Olympus BX-41 и под просвечивающим электронным A JEM-100CXII с ускоряющим напряжением 80 кв. Тотальные препараты клеток для электронной микроскопии готовили без контрастирования. Способность к магнитотаксису определяли под световым микроскопом, наблюдая изменение направления движения бактерий в зависимости от направления оси магнита, расположенного на предметном столике микроскопа.
Амплификация и клонирование фрагментов генов 16S рРНК. Выделение ДНК из биомассы бактерий проводили согласно методике, описанной ранее [16]. Амплификацию фрагментов генов 16S рРНК проводили с помощью ПЦР с использованием универсальных праймеров 11F и 1492R [17]. Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили из агарозного геля с применением набора реактивов Wizard PCR Preps ("Promega", США), согласно рекомендациям производителя. Клонирование очищенных ПЦР продуктов проводили при помощи набора реактивов pGEM-T Easy System ("Promega", США), согласно рекомендациям производителя, в штамме DH10B E. coli.
Секвенирование ПЦР-продуктов и клонированных фрагментов проводили на автоматическом секвенаторе ABI 3730 ("Applied Biosystems", США) с использованием набора реактивов Big-Dye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit ("Applied Biosystems", США), согласно рекомендациям производителя, с использованием универсальных праймеров M13F, M13R и 530F [17, 18].
Рис. 1. Морфология магнитотактических кокков р. Ольховка (г. Кисловодск): (а) — одиночная клетка; (б) — делящаяся клетка. Стрелками обозначены магнетосомы.
Филогенетический анализ. Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых бактерий с имеющимися в базе данных GenBank был проведен с помощью программного пакета BLAST http://www.ncbi.nlm.nih. gov/blast. Выравнивание последовательностей проводили с помощью программы CLUSTALW [19]. Выявление химерных последовательностей проводили с помощью сервиса chimera check, предоставляемого www.greengenes.lbl.gov [20]. Построение филогенетических деревьев исследуемых бактерий производили с использованием пакета программ MEGA 5 [21], методом neighbor-joining. Для анализа таксоономического положения последовательностей использовали также сервис Classifier, предоставляемый RDP (Ribosome Database Project, www.rdp.cme.msu.edu) [22].
Культивирование и получение чистой культуры МТБ. Полученными с помощью магнитной сепарации в капилляре ("race track") клетками МТБ инокулировали различные минимальные и комплексные среды. В качестве доноров электронов и источников углерода добавляли как по отдельности, так и в соче
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.