= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.852.083.18
ВИДОВОЙ СОСТАВ АССОЦИАЦИИ АЦИДОФИЛЬНЫХ ХЕМОЛИТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В ОКИСЛЕНИИ КОНЦЕНТРАТА ЗОЛОТОМЫШЬЯКОВОЙ РУДЫ
© 2011 г. А. Г. Булаев*, Т. А. Пивоварова*, В. С. Меламуд*, Б. К. Бумажкин**, Е. О. Патутина**, Т. В. Колганова**, Б. Б. Кузнецов**, Т. Ф. Кондратьева*,1
*Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва **Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН, Москва Поступила в редакцию 02.02.2011 г.
Культуральными и молекулярно-биологическими методами изучен видовой состав ассоциации микроорганизмов, участвующих в промышленном процессе чанового биоокисления концентрата упорной пирротинсодержащей пиритно-арсенопиритной золотомышьяковой руды Олимпиадин-ского месторождения при 39°С. Выделены чистые культуры микроорганизмов, исследованы их физиологические свойства и определено таксономическое положение на основе анализа нуклеотид-ных последовательностей генов 168 рРНК. Создана и проанализирована библиотека клонов генов 168 рРНК, полученная из тотальной ДНК, выделенной из биомассы пульпы промышленных реакторов. Культуральными методами в составе ассоциации ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов обнаружено большее разнообразие микроорганизмов (АайШюЬасШш ferrooxidans, Ьер-Ор1п11иш ferriphilum, Би^ЬасШт thermosulfidooxidans, ¥еггор1а$ша acidiphilum, АИсусЪЬасШт Шегат и Acidiphilium сгурШш), чем при анализе библиотеки клонов генов 168 рРНК (А^ ferrooxidans, Ь. fer-прЫ1иш и Г. acidiphilum). Применение микробиологических и молекулярно-экологических методов исследования биоразнообразия природных и антропогенных микробных сообществ способствует выявлению в изучаемых сообществах новых филогенетических групп микроорганизмов.
Ключевые слова: чановое биоокисление, золотомышьяковый концентрат, ассоциация ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, А^ШюЬасШт, Leptospirillum, SulfoЬacillus, Ferroplasma, секвенирование гена 168 рРНК, библиотека клонов генов 168 рРНК.
Технология чанового бактериального окисления концентратов сульфидных руд в настоящее время активно используется для получения благородных металлов на месторождениях в разных странах [1]. Окисление сульфидных руд и их концентратов осуществляется ацидофильными хемо-литотрофами — филогенетически гетерогенной группой микроорганизмов, включающей в себя представителей нескольких филумов бактерий и архей. Возможность практического применения данных микроорганизмов обусловливает интерес исследователей к различным аспектам их физиологии, экологии и филогенетики [2]. Понимание закономерностей формирования ассоциаций ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов (АХМ) в техногенных средах обитания важно для пополнения информации об этой уникальной физиологической группе микроорганизмов. Знание оптимальных условий и технологических режимов для процессов окисления сульфидных минералов при участии АХМ необходимо для интенсифика-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: kondr@inmi.host.ru).
ции и повышения эффективности процессов получения цветных и благородных металлов [3].
В последнее десятилетие внимание исследователей привлекают микробные сообщества с оптимальными температурами роста в диапазоне 40— 60°С, что связано с эффектом саморазогрева в процессах чанового окисления сульфидных минералов в результате экзотермических реакций [4]. На видовой состав ассоциаций АХМ существенное влияние оказывает температура. При температуре 40—45°С в процессах чанового биовыщелачивания доминируют представители Leptospirillum ferrooxidans, Ь. ferriphilum, AcidithioЬacillus саИт, присутствуют At. ferrooxidans, At. thiooxidans, Sulfo-ЬасШш Брр. [4—7]; при температуре 45—55°С доминируют AcidithioЬacillusсаМш, SulfoЬacШus 8рр., Аа-dimicroЬium 8рр. [8, 9].
Наше внимание было обращено на изучение микробной ассоциации, окисляющей сульфидные минералы в процессе извлечения золота из концентрата пирротинсодержащей пиритно-арсено-пиритной руды Олимпиадинского месторождения [10]. Ранее на полупромышленной установке золо-тоизвлекательной фабрики (ЗИФ) ЗАО "Полюс"
процесс окисления сульфидных минералов флото-концентрата шел при температуре 30—35°С. В сообществе микроорганизмов при этом доминировали мезофильные грамотрицательные бактерии At. ferrooxidans иAt. thiooxidans. При масштабировании процесса за счет саморазогрева пульпы температура повысилась. С помощью охлаждения реакторов водой температуру удалось удержать на уровне 39—40°С. Анализ микробной ассоциации в реакторах показал, что доминирующую роль заняли представители рода Sulfobacillus. Был выделен новый вид 'S. olympiadicus'. При мониторинге ассоциации микроорганизмов в пульпе реакторов в течение нескольких лет было отмечено замещение одних штаммов Sulfobacillus другими, выделялись также штаммы Sulfobacillus thermotolerans и S. ther-mosulfidooxidans. Присутствовали штаммы L. ferrooxidans, Ferroplasma acidiphilum, At. ferrooxidans, At. thiooxidans и гриба Aspergillus niger [11, 12].
Исследования штаммового полиморфизма у АХМ показали, что филогенетически близкие штаммы могут существенно отличаться по физиологическим свойствам, что влияет на роль конкретного изолята в процессах биовыщелачивания [13, 14].
Целью настоящего исследования явилось изучение видового состава ассоциации ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, участвующих в промышленном процессе чанового биоокисления концентрата руды Олимпиадинского месторождения при 39°С, с применением молеку-лярно-биологических и культуральных методов, особенностей физиологии чистых культур микроорганизмов и роли каждого члена ассоциации в процессе окисления сульфидных минералов.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. Объектом исследования была биомасса микроорганизмов из пробы пульпы реакторов ЗИФ ЗАО "Полюс". В состав концентрата сульфидной руды входили (вес. %): FeQ^ — 25.6, Азобщ - 9.39, 8Ъобщ - 9.50, 8общ - 22.2, Ca -3.00, C - 1.37.
Выделение чистых культур микроорганизмов.
Чистые культуры микроорганизмов выделяли методом посева жидкой фазы пульпы в десятикратных предельных разведениях на элективные среды при 30, 35, 40, 45 и 50°С. Для выделения штаммов At. ferrooxidans использовали среду 9К [15], для выделения штаммов At. thiooxidans и At. caldus - среду того же минерального состава, содержащую в качестве источника энергии элементную серу вместо сульфата железа (10 г/л). Штаммы Sulfobacillus sp. выделяли в среде 9KS, дополненной 0.02% дрожжевого экстракта (ДЭ) [16]. Штаммы Leptospirillum sp. выделяли в среде [7], содержащей 500 мМ за-кисное железо. Модифицированную среду 9К [17]
использовали для выделения Ferroplasma sp. Микроорганизмы инкубировали на ротационной качалке (170 об/мин) в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 100 мл среды и 10 мл инокулята.
Изучение фенотипических свойств микроорганизмов. Количественный учет микроорганизмов проводили методом прямого счета клеток в световом микроскопе Ampival "Carl Zeiss" (Германия) с фазово-контрастной приставкой. Влияние температуры на рост выделенных микроорганизмов изучали на среде 9К. Исследовали также способность микроорганизмов окислять закисное железо и серу в автотрофных и миксотрофных условиях. Концентрации ионов закисного и оксидного железа определяли методом комплексонометрического титрования [18]. Об окислении серы микроорганизмами судили по снижению значения рН среды.
Геносистематические исследования
Выделение ДНК из биомассы бактерий проводили согласно методу [19]. Концентрация полученных препаратов ДНК при использовании этого метода составляла 30—50 мкг/мл. РНК в полученных препаратах присутствовала в следовых количествах (менее 1%, данные электрофоретического анализа не представлены).
Амплификация гена 16S рРНК, клонирование и секвенирование полученных ПЦР-продуктов. Для
проведения полимеразной цепной реакции, клонирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК и дальнейшего секвенирования клональных вставок эубактериального происхождения использовали универсальные праймеры [20]. Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего се-квенирования архейного компонента сообщества использовали оригинальную праймерную систему [21]. Объем амплификационной смеси в обоих случаях составлял 50 мкл и имел следующий состав: 1 х буфер ДНК-полимеразы BioTaq (17 мМ (NH4)2SO4, 67 мМ трис-HCl, рН 8.8, 2 мМ MgCl2); по 12.5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмоль соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК полимеразы BioTaq ("Диалат ЛТД", Россия).
Температурно-временной профиль реакции при проведении ПЦР на ДНК-амплификаторе Gradient MasterCycler ("Eppendorf", Германия) был следующим: первый цикл — 94°С х 9 мин, 55°С х 1 мин, 72°С х 2 мин; последующие 30 циклов - 94°С х 1 мин, 55°С х 1 мин, 72°С х 2 мин; завершающий цикл — 72°С х 7 мин.
Анализ продуктов ПЦР проводили при помощи электрофореза в 2%-ном геле агарозы при напряженности электрического поля 6 В/см.
Выделение продуктов ПЦР из легкоплавкой агарозы и их очистку проводили с применением набора реактивов Wizard PCR Preps ("Promega", США) согласно рекомендациям производителя.
0.02
100
100
Clone Consensus (10 sequences) acc. N
LC
57 60
100
Acidithiobacillus ferrooxidans DSM (AJ459800) Acidithiobacillus sp. QL10-01 (JF891384)
Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270T (NC_011761) ~ Acidithiobacillus ferrivorans NO-37T (AF376020) Acidithiobacillus thiooxidans ATCC 19377T (AY552087)
100 LAcidithiobacillus albertensis DSM 14366T (NR_028982)
i-'Acidithiobacillus cuprithermicus' (AJ243934)
100
Acidithiobacillus caldeus DSM 8584 (Z29975)
-Thermithiobacillus tepidarius DSM 3134T (AJ459801)
Рис. 1. Дендрограмма нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК рода Acidithiobacillus, показывающая положение штамма Acidithiobacillus sp. OL10-01 и полученного консенсусного филотипа. Цифры указывают достоверность "bootstrap''-анализа. Приведены значения bootstrap-поддержки более 70%. Последовательности, полученные в настоящей работе, выделены жирным шрифтом. Слева вверху дан масштаб эволюционных расстояний. Алгоритм — nei
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.