ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 5, с. 558-567
ОБЗОРНЫЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СТАТЬИ
УДК 58.071:577.152.277:633.71
ВИРУС-ИНДУЦИРУЕМЫЙ САЙЛЕНСИНГ КАК МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ ФУНКЦИЙ ГЕНОВ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
© 2015 г. И. В. Жирнов1, Е. А. Трифонова1, А. В. Кочетов1,2, В. К. Шумный1,2
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090
e-mail: zh@bionet.nsc.ru
2Новосибирский государственный университет, кафедра цитологии и генетики, Новосибирск 630090
Поступила в редакцию 18.12.2014 г.
Метод вирус-индуцированного подавления генов (virus-induced gene silencing, VIGS), основанный на посттранскрипционном сайленсинге генов (posttranscriptional gene silencing, PTGS), является одним из новых перспективных методов изучения функций генов растений. В настоящем обзоре мы проанализировали работы по развитию и совершенствованию данного метода: созданию новых вирусных конструкций для различных видов растений, поиску новых генов-репортеров для контроля эффективности VIGS, а также на разработку новых эффективных способов инфицирования.
DOI: 10.7868/S0016675815050094
Изучение функций отдельных генов высших растений — важная фундаментальная задача. Наиболее часто применяемыми методами изучения функций генов являются антисмысловая супрессия их активности [1—3] или гиперэкспрессия под управлением сильного промотора, часто вирусного происхождения [4—6]. Однако оба этих подхода имеют, по крайней мере, один очевидный недостаток: трудоемкость получения трансгенных растений. Этого недостатка лишен метод вирус-индуцированного подавления генов (virus-induced gene silencing, VIGS), в основе которого лежит применение рекомбинантного вирусного вектора, несущего последовательность гена хозяина. Транскрипты эндогенного гена, гомологичные вставкам вирусного вектора, подвергаются деградации в ходе посттранскрипционного подавления генов. VIGS позволяет обойтись без трансформации растений и, следовательно, сокращает время получения результатов [7—9].
В настоящее время расшифрованы геномы многих растений, и их количество постоянно пополняется. Так, например, по предварительным оценкам, геном Arabidopsis thaliana содержит 25 тыс. генов, кодирующих белки, а геном Oryza sativa — 50 тыс. генов. Ключевая задача на данный момент заключается в идентификации функций каждого из этих генов, а также в анализе их взаимодействия между собой [10, 11]. Весьма привлекательным в подобной ситуации представляется применение метода вирус-индуцированного сай-ленсинга генов как одного из наиболее удобных и мощных методов "обратной" генетики.
Стратегия использования VIGS-анализа находит все более широкое применение в исследовании функций генов растений. В частности, этот
метод был использован для эффективного скрининга геномов многих видов: Nicotiana spp. [12— 14], Solanum spp. [9, 15, 16], A. thaliana [17, 18], Hordeum vulgare [19, 20], O. sativa [21], Glycine max [22], Papaver somniferum [23] и др. Молекулярные механизмы VIGS изучены достаточно хорошо, и сейчас основные работы по развитию и совершенствованию данного метода направлены на создание новых вирусных конструкций для различных видов растений, поиск новых генов-репортеров для контроля эффективности метода VIGS, а также на разработку новых эффективных методов инфицирования. Целью данной работы является обобщение имеющейся к настоящему времени информации относительно механизмов и особенностей использования вирус-индуцированного сай-ленсинга в качестве нового перспективного метода изучения функций генов растений.
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ VIGS
В основе метода вирус-индуцированного сай-ленсинга генов растений лежит явление РНК-интерференции (RNA interference, RNAi), известное так же как посттранскрипционный сайленсинг генов (posttranscriptional gene silencing, PTGS) [24]. Опыт по VIGS-анализу начинается с заражения растения бактерией Agrobacterium tumefaciens, которая содержит рекомбинантный вирусный вектор, несущий последовательность гена хозяина. Далее, в ходе PTGS транскрипты эндогенного гена, гомологичные вставкам вирусного вектора, считываются и регистрируются в ядре, а в цитоплазме осуществляется их деградация. Конечным результатом являются фенотипические послед-
ствия подавления целевого гена в масштабах всего растения [25, 26].
К настоящему времени общепринятой является модель, в соответствии с которой механизм посттранскрипционного сайленсинга генов можно представить следующим образом. На первом этапе в результате индукции ферментативной активности DCL-рибонуклеаз (Dicer-like dsRNAses, DCLs), характерных для высших растений и представляющих собой гомологи белка Dicer млекопитающих, происходит деградация двуцепочеч-ных форм РНК (дцРНК) [27, 28]. Образование дцРНК при использовании VIGS-векторов на основе РНК- и ДНК-содержащих вирусов обусловлено транскрипцией экспрессируемой одноцепо-чечной РНК (оцРНК) под действием вирусной или растительной РНК-зависимой РНК-полиме-разы (RNA-dependent RNA polymerase, RdRP). Гидролитическое расщепление дцРНК, катализируемое DCL, в конечном итоге приводит к образованию коротких двуцепочечных фрагментов, называемых малыми интерферирующими РНК (small interfering RNAs, siRNAs, или siPHK), длиной приблизительно 21—26 нуклеотидов, с 5'-концевой фосфатной группой и одноцепочечным выступом в 2—3 нуклеотида на З'-конце [27, 29].
На втором этапе RNAi за счет активности АТФ-зависимой РНК-геликазы происходит разделение обеих цепей образованных ранее siPHK. Одна из цепей (характеризующаяся меньшей термодинамической стабильностью 5'-конца) остается в составе мультибелкового комплекса RISC (RNA-induced silencing complex), где осуществляется ее связывание с мРНК-мишенью [27, 30]. Белок AGO1, являющийся каталитической компонентой комплекса RISC, проявляет эндонуклеаз-ную активность по отношению к мРНК, комплементарной связанному фрагменту siРНК [31, 32]. Комплементарные участку мРНК-мише-ни одноцепочечные фрагменты siPHK могут быть использованы в качестве праймеров для растительной RdRP, которая достраивает вторую цепь, используя РНК-мишень как матрицу (эффект ограничен расстоянием ~300—500 нуклеотидов в 5'-направлении от сайта первоначального расщепления). В ходе осуществляемой DCL-рибону-клеазой деградации вновь синтезированных дцРНК происходит образование новых siPHK, которые называют вторичными. Таким образом осуществляется амплификация сигнала [27, 33]. Вторичные siPHK в дальнейшем могут не только участвовать в прямой деградации мРНК-мишени в составе RISC, но и транспортироваться между клетками по плазмодесмам в качестве сигнальных молекул. Подобный симпластный транспорт является белок-опосредованным (в частности, достоверно идентифицирован белок, избирательно транспортирующий siPHK длиной 25 нуклеотидов) [34].
ВЕКТОРНЫЕ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ VIGS-АНАЛИЗА В РАСТЕНИЯХ
Для подавления экспрессии генов в растениях с использованием метода VIGS применяют разнообразные генетические конструкции. Разработано более 20 векторных систем, которые были успешно опробованы на различных растениях, как однодольных, так и двудольных [35]. Выбор вируса, который будет использован в качестве основы при разработке новой VIGS-системы, ограничен целым рядом требований. Во-первых, вирус должен вызывать мягкие симптомы поражения, не маскирующие эффект или фенотипические последствия сайленсинга целевого гена. Во-вторых, вирус должен быть патогенен для как можно большего числа видов растений. И, наконец, необходимо учитывать такой фактор, как безопасность рассматриваемого вируса [26, 35]. В соответствии с указанными требованиями, в качестве подходящих инфекционных агентов при разработке новых VIGS-векто-ров используют представителей родов (таблица) Hordeivirus, Comovirus, Bromovirus, Tobravirus, Cucu-movirus, Carlavirus, Potexvirus, Tobamovirus, Cheravi-rus (РНК-содержащие вирусы), а также Begomovi-rus, Geminivirus (ДНК-содержащие вирусы).
Эффективность инфицирования и подавления экспрессии генов для одного и того же вектора в значительной степени зависит от вида исследуемого растения. Первые эксперименты по VIGS-анализу были проведены на модели N. benthami-ana с использованием векторных конструкций, полученных на основе вируса табачной мозаики (tobacco mosaic virus, TMV) и вируса картофеля X (potato virus X, PVX) [40, 82]. В то же время опыты были направлены на разработку новых векторных систем, дающих стабильные и повторяющиеся результаты и пригодных для использования на как можно большем диапазоне видов растений. Так, был разработан вектор на основе вируса по-гремковости табака (tobacco rattle virus, TRV), который в настоящее время широко применяется для VIGS-анализа [83, 84]. TRV является патогенным для более 400 видов растений. Геном TRV представлен двумя сегментами (А и В) позитивной оцРНК. В последовательности А-сегмента (~6.8 тн) закодированы три вирусных полипептида: RdRP, транспортный белок MP и 16-кДа ци-стеин-обогащенный белок (16К), который играет ключевую роль в эффективной аккумуляции TRV. В-сегмент (~4.5 тн) кодирует капсидный белок (coat protein, CP), а также два неструктурных белка, кодирующая последовательность которых в соответствующем VIGS-векторе замещена на область, содержащую либо цитотоксичный ген ccdB, фланкированный attR-сайтами рекомбинации, либо множественные сайты клонирования (multiple cloning sites, MCSs). Усовершенствованную систему векторов на основе TRV (YL192 и
Вирусы — источники векторов для УЮ$-анализа и примеры их использования для сайленсинга генов в органах растений
Вирус — источник вектора Род Примеры использования вектора для сайленсинга генов в органах растений Ссылки
Вирус табачной мозаики (tobacco mosaic virus, TMV) Tobamovirus Nicotiana tabacum, N. benthamiana (листья) [36, 37]
Х-вирус картофеля (potato virus X, PVX) Potexvirus N. benthamiana (листья), Solanum tuberosum (листья и клубни) [38-41]
Вирус погремковости табака (tobacco rattle virus, TRV) Tobravirus Hyoscyamus niger (листья), Aquilegia vulgaris (цветы), Papaver somniferum, Eschscholzia californica (листья и цветы), N. benthamiana, N. tabacum, S. lycopersicum, Arabidops
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.