БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 8, с. 1195 - 1204
УДК 577.612.127
ВИРУС КОКСАКИ ТИПА B3 ВЫЗЫВАЕТ АУТОФАГИЮ В КАРДИОМИОЦИТАХ in vivo*
© 2015 Ксиа Жей1#, Бинг Бей3#, Бохей Ю1, Тенайинг Венг1, Хуапенг Венг2, Яо Венг2, Хуиян Ли3, Лей Тонг1, Ян Венг1, Фенгмин Женг1, Вернан Жао2**, Жаохуа Жонг1**
1 Harbin Medical University, Department of Microbiology,
194Xuefu Road, Harbin 150086, China; E-mail: zhonghzh@hrbmu.edu.cn
2 Harbin Medical University, Department of Cell Biology,
194Xuefu Road, Harbin 150086, China; E-mail: zhaowr@ems.hrbmu.edu.cn, zhaowenran2002@aliyun.com
3 First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Department of Cardiology, 23 Youzheng Street, Harbin 150001, China
Поступила в редакцию 20.11.14 После доработки 09.02.15
Вирусный миокардит — это общее заболевание, приводящее к хронической кардиомиопатии и нарушению сердечной деятельности. Вирус Коксаки типа В (CVB) является одним из главных патогенов, вызывающих вирусный миокардит. Ранее показано, что аутофагия способствует репликации CVB в клетке хозяина. В представленной работе миокардит вызывали у мышей Balb/c 3-недельного возраста путем введения им вируса Коксаки, и затем изучали результаты воздействия вирусной инфекции на клетки миокарда (кардиомио-циты). Исследования, проведенные методом электронной микроскопии, показали, что напоминающие ау-тофагосомы везикулы появлялись в кардиомиоцитах зараженных мышей на 3-, 5- и 7-й дни после введения CVB. При этом в миокарде инфицированных вирусом мышей и в кардиомиоцитах, изолированных из желудочков сердца зараженных животных, существенно возрастал уровень липидированной формы легких цепей 3 (LC3), ассоциированных с микротрубочками белка 1 (т.е. происходила трансформация цитоплазмати-ческого белка LC3-I в мембранный белок аутофагосом — LC3-II). Увеличение уровня белка LC3-II происходило одновременно с нарастанием количества вирусной РНК и белка в миокарде или в изолированных кардиомиоцитах. Уровни экспрессии вирусной РНК и продукции вирусного белка в первичной культуре кардиомиоцитов существенно снижались после обработки клеток ингибитором аутофагии — 3-метиладени-ном (3-MA). Помимо этого, было обнаружено, что в миокарде и в кардиомиоцитах инфицированных мышей возрастал уровень экспрессии и повышалась степень фосфорилирования протеинкиназы ERK (extracellular signal regulated kinase), хотя роль этого фермента в регуляции аутофагии еще не выяснена. Таким образом, было продемонстрировано, что ответом кардиомиоцитов на введение CVB является активизация процесса формирования аутофагосом in vivo, что может способствовать репликации вируса.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: вирус Коксаки В, кардиомиоциты, миокард, аутофагия, аутофагосома.
Вирусный миокардит — широко распространенное заболевание, сопровождающееся серьезными осложнениями и приводящее к гибели животных в детском и юношеском возрасте [1—3]. Среди наиболее известных вирусных патогенов, вызывающих миокардит, особо выделяется вирус Коксаки типа В (CVB) [4—5]. Он относится к группе энтеровирусов (Enterovirus) семейства пикорнавирусов (Picornaviridae); у CVB отсутствует оболочка, а геном представляет со-
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 14-311, 12.04.2015.
** Адресат для корреспонденции.
# Авторы внесли равный вклад в работу.
бой одноцепочечную РНК. Несмотря на то, что большинство вызываемых этим вирусом сердечных патологий протекают бессимптомно, серьезные формы миокардитов могут привести к повреждению миокарда и остановке сердца [6—8]. Примерно у 10% пациентов с симптомами вирусного миокардита в конце концов развивается хроническая кардиомиопатия [9—11]. Ранее было установлено, что в развитие вызываемого СУБ миокардита помимо прямого вирусного поражения миокарда вносит свой вклад и иммунная система организма хозяина, однако, механизмы патогенеза этого заболевания еще предстоит выяснить [12—14]. Исследования последних лет показали, что процесс инфицирования вирусом СУБ включает в себя аутофагию [15—20].
Аутофагия — это протекающий во многих клетках естественный катаболический процесс, при котором долгоживущие белки и поврежденные органеллы деградируют в лизосомах [21]. Считается, что аутофагия может служить для обеспечения клетки питательными веществами и энергией в условиях голодания, при повреждении или патогенной инвазии [22, 23]. Процесс аутофагии начинается с формирования в цитоплазме клеток небольшой плоской замкнутой мембранной структуры непонятного происхождения, напоминающей распластанный пустой мешочек и известной под названием «изолированная мембрана» или «фагофор». Такой плоский мембранный мешок затем увеличивается, вытягивается, потом изгибается и, наконец, замыкается, образуя везикулу — аутофагосому, окруженную двумя липидными бислоями и включающую в себя те или иные внутриклеточные компоненты. Впоследствии эта аутофагосома сливается с лизосомой с образованием аутофа-голизосомы, где и происходит деградация заключенного в ней клеточного материала под влиянием лизосомальных ферментов [24, 25]. Ауто-фагия играет важную роль при вирусной инфекции. Некоторые вирусы способны избегать переваривания, тогда как другие, например, CVB могут использовать аутофагию для стимуляции своей репликации [17, 18].
Из литературы известно, что CVB3 и CVB4 могут индуцировать образование аутофагосом in vitro, а ингибирование процесса аутофагии приводит к снижению продукции вирусных частиц [17—19]. Предполагается, что CVB3 ингибирует слияние аутофагосом с лизосомами и тем самым обеспечивает себя достаточным количеством мембранных структур, на которых осуществляется самосборка вирусного РНК-репликативного комплекса [26]. Взаимосвязь между репликацией CVB и аутофагией была продемонстрирована также и in vivo. На клетках HeLa и на панкреатических клетках было показано, что CVB3 индуцирует образование аутофагосом и ингибирует их слияние с лизосомами [18]. Специфическое нарушение аутофагии в ацинарных панкреатических клетках значительно тормозило репликацию CVB, особенно на ранних стадиях инфицирования, и улучшало функционирование поджелудочной железы [17]. Учитывая все эти данные, можно предположить, что блокирование аутофагии может быть использовано в качестве способа борьбы с CVB инфекцией. Однако оставалось неясным, имеется ли взаимосвязь между вирусной репликацией и аутофагией в клетках миокарда, являющихся первичной мишенью для CVB.
Аутофагия была необходима для поддержания структуры и функционирования кардиомио-
цитов [27]. Например, было установлено, что генетически обусловленный недостаток белка Atg5 (autophagy protein 5) у мышей приводил к развитию сердечной дисфункции, сопровождающейся расширением желудочков, тогда как при стимуляции аутофагии путем экспрессии дополнительного количества Atg7 наблюдалось улучшение в функционировании миокарда и увеличивалась продолжительность жизни этих животных [28]. Напротив, естественная аутофа-гия в ацинарных клетках поджелудочной железы могла и не играть большой роли, поскольку недостаток Atg5 почти не оказывал влияние на морфологию и функционирование этих клеток [17]. Возможно, что биологическое значение ау-тофагии не одинаково в клетках различных типов. Ну и наконец, было замечено, что аутофа-гия активируется при ишемии миокарда и кар-диомиопатии, вызванной генетическими отклонениями от нормы [23—27, 29].
Признавая важность аутофагии для функционирования кардиомиоцитов, мы попытались ответить на вопрос, может ли CVB3 провоцировать аутофагию в этих клетках. В качестве модели были использованы мыши, зараженные CVB3 и заболевшие вирусным миокардитом. Также изучена роль аутофагии в репликации вируса в первичной культуре кардиомиоцитов, обработанных ингибитором аутофагии 3-метил -аденином (3-MA). Все полученные данные свидетельствовали о том, что заражение животных вирусом CVB3 вызывало аутофагию в кардио-миоцитах in vivo и это способствовало размножению вируса.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Антитела и химические реактивы. Поликло-нальные антитела против энтеровирусного белка VP1 (M 7064, «Dako», США), антитела против белка LC3-I/II (L7543; «Sigma», США), против ERK1/2 и фосфо-ЕЯК1/2 (9102L и 9101, «Cell Signaling», США) и антитела против р-актина (TA09, «Zhongshan Golden Bridge», Китай) использовали в разведении 1 : 1000; вторичные козьи антимышиные IgG, коньюгированные с перок-сидазой хрена (2B-2305, «Zhongshan Golden Bridge», Китай) — в разведении 1 : 5000,3-метил-аденин (3-MA, «Sigma-Aldrich», США).
Клеточная культура и вирус. Клетки HeLa культивировали в среде RPMI 1640 («Life Technologies», США) с добавкой 5%-ной фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS, «Bio-logical Industries», Израиль) и смеси антибиотиков (пенициллин—стрептомицин). Вирус CVB3 штамма Нэнси был получен в Центре контроля
эндемических заболеваний Китая. Вирус размножали в клетках HeLa, культивированных как описано выше. Титр вируса определяли путем подсчета бляшек лизиса [30] и выражали в ФФЕ/мл (фокус-формирующие единицы).
Заражение мышей вирусом. Линейные мыши Balb/c были получены из питомника Харбинского медицинского университета. Эксперименты с животными были выполнены в соответствии с Правилами по работе с лабораторными животными Харбинского медицинского университета. Самцам мышей 3-недельного возраста внутрибрюшинно вводили CVB3 (1,2 х 108 ФФЕ/0,3 мл). Через 0, 3, 5 и 7 дней с момента инфицирования мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков. Сердца перфузиро-вали обратным током через аорту 10 мл раствора 2%-ного параформальдегида и 2%-ного глута-ральдегида в 100 мМ Na-какодилатном буфере с рН 7,4 при комнатной температуре. Немедленно после перфузии сердца удаляли, желудочки вырезали и использовали для гистопатологическо-го и электронно-микроскопического исследований и для экстракции РНК и белка.
Изоляция кардиомиоцитов и их заражение вирусом. Первичную культуру мышечных клеток (кардиомиоцитов) из миокарда желудочков сердца получали как было описано ранее [31, 32]. Чистоту препарата определяли визуально с помощью фазово-контрастного микроскопа. Изол
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.