БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 4, с. 534 - 543
УДК 612.127
ВИРУС КОКСАКИ ТИПА В3 ПРОВОЦИРУЕТ МИОКАРДИТ У МЫШЕЙ ПУТЕМ СТИМУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ Toll-ПОДОБНОГО РЕЦЕПТОРА 4
© 2015 Жао Жао1, Тян-Жи Кей2, Ян Ли1, Вен-Джун Лиу1, Мен-Ли Ченг1, Ю-Кьянг Джи1*
1 First hospital of Xi'an, Department of Cardiovascular Medicine, China, 710002 Xi'an; fax: +86(29)876-30855, E-mail: jiyuqiangdr@yeah.net
2 Affiliated Hospital of Xi'an Medical University, Department of Cardiovascular Medicine, China, 710077Xi'an
Поступила в редакцию 29.01.14 После исправления 16.01.14
Изучены развитие миокардита, провоцируемого вирусом Коксаки типа 3 (CVB3), и механизм защитного действия малых интерферирующих РНК (siPHK) на пораженный вирусом организм. Работа была выполнена на 120 мышах, 30-ти из которых был внутрибрюшинно введен CVB3 (их затем использовали в качестве модельных животных с вирусным миокардитом). Фиксировали выживаемость зараженных вирусом мышей (мыши «MOD») и отслеживали нанесенные вирусом повреждения с помощью гистопатологического исследования срезов миокарда, окрашенных гематоксилином и эозином (НЕ). Транскрипционную и трансляционную экспрессию гена TLR4 в тканях миокарда изучали методом ПЦР в режиме реального времени и методом иммуноблоттинга соответственно. Также было проведено специфическое блокирование гена TLR4 у мышей «MOD» путем обработки животных малой интерферирующей РНК и изучены последствия этого блокирования. Полученные результаты свидетельствовали о том, что при прогрессии вирусного миокардита у мышей «MOD» уровни TLR4 мРНК и белка TLR4 в миокарде значительно увеличивались и оставались высокими в дальнейшем. Помимо этого, установлено, что активность некоторых ферментов миокарда (CK, CK-MB, LDH и AST) также была увеличена в тканях сердца зараженных вирусом мышей. Отмечено, что при подавлении экспрессии гена TLR4 продукция белка TLR4 у мышей «MOD» существенно снижалась и степень тяжести миокардита уменьшалась. Таким образом, CVB3 может провоцировать вирусный миокардит путем стимуляции экспрессии Toll-подобного рецептора 4. Степень тяжести миокардита может быть снижена путем подавления экспрессии гена TLR4; это является подходящей основой для разработки метода лечения этого вирусного заболевания.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: вирусный миокардит, вирус Коксаки типа B3, Toll-подобный рецептор 4, ферменты миокарда.
С клинической точки зрения вирусный миокардит является главной причиной повреждения миокарда у животных в раннем возрасте и часто приводит к развитию хронического миокардита, провоцирует кардиомиопатию и застойную сердечную недостаточность [1, 2]. Известно, что вирус Коксаки типа В3 (СУБЗ) выступает и в качестве наиболее распространенного агента, вызывающего миокардит у человека [3]. Проведенные недавно исследования показали,
Принятые сокращения: CVB3 — коксаки-вирус В3; siPHK — малые интерферирующие РНК; TLR4 — Toll-по-добный рецептор 4; TLR4/NF-kB — Toll-подобный рецептор 4/ядерный фактор кВ-зависимый сигнальный путь; AST — аспартаттрансаминаза; CK — креатинкиназа; CK-MB — изозим креатинкиназы, присутствующий в миокарде; LDH — лактатдегидрогеназа.
* Адресат для корреспонденции.
что еще очень мало известно об особенностях патогенеза вирусного миокардита, поэтому пока нет эффективных лекарств и методов лечения этого заболевания.
Вирус СУБЗ может вызывать серьезные воспаления, приводящие к повреждению клеток сердечной мышцы [4, 5]. Предполагается, что воспаление может быть связано с активацией сигнального пути, регулируемого То11-подобным рецептором 4/ядерным фактором кБ (ТЬЯ4/ /МБ-кВ-зависимый сигнальный путь) [6, 7]. Ключевые факторы этого регуляторного пути, и в особенности, ТЬЯ4, малоизучены и представлены, в основном, в работах Фрисанчо-Кисс и соавт. [8, 9]. Описаны также некоторые методы терапевтического лечения, связанные с воздействием на этот сигнальный путь [10]. Зоу и соавт. [11] сообщили, что ТЬЯ4/МР-кВ-зависи-
мый путь принимает участие в регуляции врожденного иммунного ответа при миокардите. Однако специфический механизм развития TLR4/ /NF-кВ-зависимого вирусного миокардита по-прежнему не известен. Таким образом, поиск препаратов, специфически воздействующих на ^К4/№-кВ-зависимый сигнальный путь, является ключом к разработке способов лечения миокардита.
В представленной работе CVB3 был использован в модельных условиях для индукции миокардита у мышей (мыши «MOD»). Для выяснения механизма развития вирусного миокардита мы изучали экспрессию фактора TLR4 с использованием модели СУВ3-инфицированных мышей.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Животные и вирусы. Мыши линии BALB/C 6-недельного возраста весом 20 г были приобретены в питомнике Джиаотонг университета в Сиане. Все животные были свободны от патогенов. Вирус Коксаки линии Nancy, поддерживаемый пассированием на клетках HeLa, был получен из Медицинского колледжа этого же университета. Значение TCID50 вируса (доза 50%-ного инфицирования клеточной культуры) было предварительно определено стандартным методом на монослое клеток HeLa. Работу с животными осуществляли согласно правилам о работе с лабораторными животными, утвержденными Министерством здравоохранения Китая от 1998 г. Исследования были одобрены комитетом по этике первой клиники Сианя.
Подразделение животных на группы и их обработка. Предназначенные для исследования животные (120 шт.) были подразделены на 4 группы (по 30 шт.): 1) контрольная группа («CN»); 2) группа животных, обработанных средой Дульбекко («DMEM»); 3) мыши, инфицированные CVB3 («MOD»); 4) мыши MOD, обработанные TLR4-специфичной 81РНК («TLR4 silence»), или обработанные контрольной плазмидой («RNA silence control»). Мышам «MOD» в день «0» вводили внутрибрюшинно CVB3 в количестве 1 х 102 TCID50. Группе «DMEM» вводили аналогичный объем среды Дульбекко. Контрольную группу «CN» ничем не обрабатывали. Животным четвертой группы в день «0» вводили внутрибрю-шинно 1 х 102 TCID50 вируса CVB3 и затем также внутрибрюшинно 0,2 мкг вектора экспрессии pRNAT-U6.1/Neo siRNA («TLR4 silence»), либо -0,2 мкг контрольной плазмиды («RNA silence control»). Эти введения (трансфекция) также осуществляли в день «0» при одновременной инъ-
екции 0,2 мкл реагента для трансфекции (Lipo-fectamine 2000, «Invitrogen», США). (Введение плазмид проводили не в те же места, в которые был введен вирус.)
Гистопатологические исследования и оценка степени тяжести миокардита. На 7-й, 14-й и 21-й день после инфицирования вирусом сердца животных извлекали, делали срезы ткани и окрашивали гематоксилином и эозином (НЕ). Окрашенные срезы анализировали «слепым» методом двумя независимыми экспертами и степень тяжести миокардита определяли как описано ранее [12]. Тяжесть миокардита оценивали по шкале от 0 до 4 - отсутствие воспаления или повреждения; 1 - от одного до пяти различных одноядерных очагов воспаления, поразившего <5% области поперечного среза сердечной ткани; 2 - более пяти различных одноядерных очагов воспаления, затронувшего от 5 до 20% рассматриваемой области поперечного среза; 3 -диффузное одноядерное воспаление (или повреждение) ткани, затрагивающее более 20% области среза; 4 - диффузное воспаление с некрозом или повреждением миокарда.
Полуколичественный анализ методом ПЦР в режиме реального времени. Для анализа транскрипционной экспрессии TLR4 были использованы следующие праймеры: прямой 5'-GAAT-CACTTGGCACGACACTT-3' и обратный 5'-GC-TCGCCCACGTACATACTCT-3'. В качестве внутреннего контроля был использован ген глице-ральдегид 3-фосфатдегидрогеназа (GADPH) и следующие праймеры: прямой 5'-AAGCCCAT-CACCATCTTCCAG-3', обратный 5'-TGAGCC-CTTCCACAATGCC-3'. Синтез TLR4 кДНК проводили с использованием набора RNAsimple Total RNA Kit («Tiangenl», Китай) и SuperScript™ III First-Strand Synthesis System («Invitrogen», США). Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 1,5%-ном геле, каждое изображение захватывали и переводили в цифровую форму с помощью CCD-камеры и анализировали с использованием программы NIH Imager beta version 2. Каждое значение представляли как отношение сигнала специфического продукта к сигналу от GADPH кДНК. Все процедуры и статистический анализ выполняли, как было описано в работе [13].
Определение ферментативной активности ас-партаттрансаминазы (AST), креатинкиназы (CK), изозима креатинкиназы (CK-MB) и лактатде-гидрогеназы (LDH) в бесклеточных супернатан-тах гомогенатов сердечной ткани проводили с использованием полностью автоматизированного биохимического анализатора в соответствии с инструкциями производителя («Thermo», США).
Вестерн-блоттинг. Миокард мышей гомогенизировали, получали тканевые экстракты, разделяли путем Ds-Na-электрофореза в 15%-ном ПААГ и переносили белки на нитроцеллюлоз-ные мембраны. Мембраны блокировали 5%-ным обезжиренным молоком в буфере PBST (фосфатная буферная смесь с рН 7,6, содержащая 0,05%-ный Tween-20) в течение ночи при 4°. Затем мембраны инкубировали с моноклональны-ми анти-TLR4 антителами в разведении 1 : 500, с моноклональными антителами к GADPH в разведении 1 : 2000 (все — «Santa Cruz», США) в течение 1 ч при 37° и, наконец, с коньюгатом пе-роксидазы хрена и вторичных антител против IgG мыши («Santa Cruz») в разведении 1 : 3000. Все процедуры выполняли в соответствии с методикой, описанной Ксу и соавт. [14].
Проектирование TLR4-специфичной siРНК и трансфекция. Три 7Х^4-специфичные олигоде-зоксирибонуклеотидные последовательности (5'-GCATAGAGGTAGTTCCTAATA-3', 5'-CAC-TCTTGATTGCAGTTTCAA-3' и 5'-GTTCCATT-GCTTGGCGAA-3') были синтезированы и подвергнуты отжигу. Пара двуцепочечных ДНК-оли-гонуклеотидов была вставлена в вектор экспрессии pRNAT-U6.1/Neo siRNA, который расщепляется рестриктазами BamHI и HindIII («GenScript», США). Вектор pRNAT-U6.1/Neo siRNA (0,2 мкг) вводили внутрибрюшинно мышам (трансфек-ция) сразу же после инокуляции CVB3, но не в то же место, что и вирус.
Статистический анализ. Изображения, полученные при иммуноблоттинге, сканировали с использованием программы Typhoon («Pharmacia», США) и сохраняли в TIF-формате. Все данные представляли как средние значения ± s.d. Статистический анализ выполняли с использованием п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.