МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 5, с. 876-884
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 577.218
ВИРУСНЫЙ ПРОМОТОРНО-ЭНХАНСЕРНЫЙ ЭЛЕМЕНТ ИНГИБИРУЕТ РЕПЛИКАЦИЮ АВТОНОМНО РЕПЛИЦИРУЮЩИХСЯ ПЛАЗМИД В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
© 2003 г. Ю. В. Анискина, С. И. Горностаева, Л. Е. Андреева, В. В. Ненашева,
В. 3. Тарантул, А. И. Николаев*
Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва, 123182 Поступила в редакцию 12.12.2002 г.
Для изучения автономной репликации конструкций, содержащих одновременно элементы репликации и транскрипции, впервые были созданы гибридные плазмиды, несущие ori/ARS-элементы высших эукариот и промоторно-энхансерный элемент цитомегаловируса (CMV). ARS-элемент, использованный для создания рекомбинантной плазмиды pCI.ARS-neo, получен из клонированной нами ранее автономно-реплицирующейся плазмиды pr8a - стабильного автономного трансгена шелкопряда Bombyx mori. В качестве элемента репликации для конструирования плазмиды pCI.ori-neo использовали описанный ранее фрагмент хромосомного ori локуса гена c-myc человека. В опытах по поддержанию плазмид pCI.ARS-neo и pCI.ori-neo в трансгенных мышах, а также в культуре имморта-лизованных Т-клеток человека обнаружено взаимовлияние репликации и транскрипции, которое в обоих случаях свидетельствует об ингибирующем действии CMV-элемента транскрипции на автономную репликацию модельных конструкций. Этот эффект может отражать некоторые особенности противоречивых отношений транскрипции и репликации генома в клетках высших эукариот.
Ключевые слова: эукариоты, репликация, транскрипция, сопряжение, трансгены, CMV-элемент транскрипции, гибридные плазмиды.
К концу 80-х годов при сопоставлении данных, полученных на таких объектах, как Escherichia coli и дрожжи, возникло предположение о том, что существует взаимное влияние процессов репликации и транскрипции. Так, в частности, было отмечено, что на хромосоме E. coli сильные промоторы ориентированы в сторону, противоположную направлению репликации с oriC [1], а также, что транскрипция ДНК, содержащей ARS-элемент, негативным образом влияет на его функцию [2, 3]. Несколько позднее было показано, что транскрипция участков ДНК хромосомы E. coli в направлении навстречу движению репли-кационной вилки приводит к уменьшению скорости этого движения [4].
Взаимосвязь регуляции транскрипции и репликации у высших эукариот на данный момент не изучена. Это связано с тем, что хромосомные участки ori больше по размеру и значительно более сложно устроены, чем соответствующие элементы прокариот и одноклеточных эукариот [5]. Важнейшей особенностью ori высших эукариот, также усложняющей их анализ, является то, что большинство из них локализованы в регулятор-
Принятые сокращения. ori - область начала репликации ДНК; ARS - автономно-реплицирующаяся последовательность; CMV - цитомегаловирус.
*Эл. почта: nikolaev@img.ras.ru
ных районах генов [6, 7] (рис. 1а), где локализованы промоторы и энхансерные/сайленсерные элементы транскрипции [7]. Какова функциональная значимость присутствия этих элементов в вп сейчас неизвестно. Поэтому большое значение приобретают модельные исследования, в ходе которых функционирование различных генетических элементов и их комбинаций изучается не на хромосомном уровне, а на автономных (эписом-ных) рекомбининтных конструкциях, что упрощает интерпретацию результатов (рис. 16). Первые данные в этом направлении, полученные в 90-х годах на рекомбинантных плазмидах, содержащих 5'-регуляторные участки гена с-тус, свидетельствуют об информативности такого подхода [8, 9] (рис. 16).
Ранее нами исследовано явление трансгеноза на модели тутового шелкопряда В. твп. Установлено, что трансгены у этого организма локализованы преимущественно экстрахромосомно - независимо от природы переносимой ДНК [10, 11]. В ходе переноса и передачи по наследству в экстрахромосомных трансгенах шелкопряда, как правило, происходят перестройки по механизму негомологичной рекомбиниции экзогенной ДНК с ДНК клетки хозяина, по-видимому, - с эписом-ной ДНК, от которой экзогенная ДНК получает
Рис. 1. Схема структуры хромосомного участка ori в локусе гена c-myc и конструкция автономного вектора, содержащего фрагмент этого ori на основе данных работ [8, 9]). а - Экзон-интронная схема EcoRI-фрагмента локуса гена c-myc с прилегающей 5'-областью, содержащей фрагмент ori и промоторы гена. Черный прямоугольник - фрагмент ori c-myc, достаточный для поддержания автономного статуса плазмиды; г-образные стрелки - промоторы гена; серые прямоугольники - экзоны гена; овалы - картированные фрагменты зоны инициации репликации хромосомного ori локуса c-myc. E - EcoRI, H - HindIII, X - Xhol. б - Структура рекомбинантной автономной плазмиды pNeo.Myc-2.4, содержащей фрагмент ori c-myc длиной 2.4 т.п.н., ген neor под контролем MMT-промотора и сигнала терминиции и по-лиаденилирования SV40.
ARS-элементы, необходимые для поддержания своей копийности в клетке [11, 12].
Была клонирована стабильная автономно-реплицирующаяся плазмида pr8a, передающаяся по наследству без изменений. Более того, при микроинъекции собственно pr8a в зародыши тутового шелкопряда она поддерживалась у насекомых в интактном виде (в отличие от всех использованных ранее плазмид). В состав pr8a входит часть последовательности бактериального вектора pBR322 (обеспечивающая его репликацию в E. coli) и последовательность ДНК шелкопряда (4 т.п.н.), несущая ARS, т.е. pr8a является челночной плазмидой [10, 11, 13]. Для исследования степени универсальности механизма автономной репликации данной плазмиды были поставлены опыты по переносу p^ в дрожжи и в мышь. В первом случае несущую ARS последовательность pr8a, а также ее делеционные варианты, клонировали в дрожжевом интегративном векторе, а во втором -pr8a переносили в интактной форме. Оказалось, что в трансформированных дрожжах близкая к полноразмерной небактериальная последовательность pr8a (3.95 т.п.н.) и ее минимизированная часть (центральный РуиП-фрагмент, 2.3 т.п.н.)
функционировали как ARS и обеспечивали поддержание рекомбинантных трансгенов без их интеграции в геном [11, 12]. В трансгенных мышах трансгены, гомологичные pr8a, существуют также в экстрахромосомной форме, даже и в Б2-по-колении. То же наблюдали и в опытах на трансгенном шелкопряде, в которых появлялся стабильный трансген - плазмида p8-2. Показано, что в p8-2 сохранена та часть pr8a, где локализован ARS, имеющий размер 2.3 т.п.н. [11]. Таким образом, данный элемент, составляющий половину небактериальной последовательности pr8a, обеспечивает автономное поддержание трансгенов как в трансформированных клетках дрожжей, так и в клетках хвоста трансгенных мышей. В последнем случае "адаптированный" к гетерологи-ческой хозяйской системе (мышь) ARS (2.3 т.п.н.) обеспечивает увеличение копийности трансгена p8-2 в клетках хвоста Б2-поколения мышей до приблизительно 10-15 копий на геном [11]. При частичном секвенировании p8-2 обнаруживается сходство с некоторыми известными ранее ori/ARS-элементами и, кроме того, показано, что в них есть несколько последовательностей, близких к
консенсусной ARS-последовательности дрожжей (9 совпадений из 11) [12].
Исходя из сказанного, можно рассматривать конструкции pr8a и p8-2 наряду с плазмидой pNeo.Myc-2.4, содержащей фрагмент хромосомного ori, локализованного в локусе гена c-myc [8, 9] (дар проф. М. Леффака А. Николаеву), как исходные конструкции, удобные для изучения механизмов автономной репликации в клетках эука-риот.
В данной работе мы предприняли попытку охарактеризовать автономную репликацию упомянутых плазмид при введении элемента транскрипции встык с элементом репликации. На основе ARS pr8a, имеющего размер 2.3 т.п.н. и ARS-фрагмента хромосомного ori, имеющего размер 2.4 т.п.н., созданы модельные плазмиды pCI.ARS-neo и pCI.ori-neo соответственно. Для получения этих конструкций использован вектор pCI-neo ("Promega"), содержащий промоторно-энхансер-ный элемент цитомегаловируса. ARS-элемент из состава pr8a и фрагмент хромосомного ori из pNeo.Myc-2.4 вставлены в pCI-neo непосредственно перед CMV-элементом.
При переносе модельных конструкций в про-нуклеус мыши и в культуру иммортализованных Т-клеток человека с последующим получением трансгенных мышей FO-поколения и стабилизированных клеточных культур показано, что эти плазмиды в ряде случаев действительно имеют, как это и ожидалось, автономный статус. Однако копийность этих конструкций в клетках-мишенях была низкой по сравнению с неэкспрессионным контролем. Согласно нашим результатам, поддержание гомологичных трансгенов в малом числе копий обусловлено тем, что функционирование CMV-элемента ингибирует их автономную репликацию.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Получение трансгенных мышей и стабильных трансфицированных клеточных культур. Трансгенные мыши получены, как это описано нами ранее [11, 13].
Для трансфекции иммортализованных Т-клеток 15 мкг ДНК конструкции pCI.ori-neo или pNeo.Myc-2.4 смешивали с клеточной суспензией (106) клеток, после чего с помощью электрического разряда напряжением 600 в, используя оригинальную ячейку прибора "СУМ-4" (Россия), плазмидную ДНК переносилили в клетки. Клоны трансфицированных Т-клеток отбирали по устойчивости к антибиотику G-418 ("Promega"). Процедура селекции продолжалась 14 дней. После этого стабилизированные по устойчивости к антибиотику поликлональные и моноклональ-ные культуры клеток вели на модифицированной
по Дульбекко среде Игла ("Gibco") с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при 37°С в С02-инкубаторе (5% С02).
Конструирование гибридных плазмид. При генно-инженерных процедурах использовали известные плазмиды: pCI-neo ["Promega"], pr8a [10, 11] и pSK ("Stratogene"). Вектором для конструирования плазмид, содержащих фрагменты ДНК трансгена pr8a, служила интегративная плазмида pCI-neo ("Promega") с селективным маркером - геном устойчивости к антибиотику неомицину G-418.
Для получения конструкции pCI.ARS-neo PvuII-фрагмент pr8a (2.3 т.п.н.), несущий ARS pr8a клонировали в затупленном BglII-сайте pCI-neo (непосредственно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.