МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том S2, № 4, с. 502-509
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579.222.в:579.23:53.08в:в15.281
ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОГО ПОЛИМЕРНОГО МАТРИКСА БИОПЛЕНОК СИЮМОВЛСТЕЯШМ ГЮЫСЕиМ С ПОМОЩЬЮ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
© 2013 г. М. В. Журина*, Н. А. Кострикина*, Е. Ю. Паршина**, Е. А. Стрелкова*, А. И. Юсипович**, Г. В. Максимов**, В. К. Плакунов*, 1
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва **Биологический факультет МГУ, кафедра биофизики Поступила в редакцию 09.01.2013 г.
БО1: 10.7868/80026365613040162
Ранее нами были представлены результаты, свидетельствующие о прямой корреляции между способностью к формированию полноценного матрикса и чувствительностью микробных биопленок к тепловому, гиперосмотическому и кислотному шоку [1]. В частности, было проведено сравнительное изучение чувствительности к указанным факторам беспигментного (не образующего виолацеина) штамма Chromobacterium violaceum WT, обладающего нормальной системой quorum sensing и способностью к формированию матрикса, а также мутанта C. violaceum CV026 с нарушением синтеза N-ацилгомосеринлактонов (АГЛ), компонентов регуляторной системы quorum sensing, и сниженной способностью к формированию матрикса. Синтез виолацеина у штамма CVO26 индуцируется N-гексаноилгомосеринлак-тоном (С6-АГЛ), а также другими АГЛ с длиной боковых ацильных цепочек от С4 до С8, благодаря чему его используют как биосенсор на АГЛ [2]. В ранее описанных экспериментах [1] количественную оценку синтеза матрикса биопленок мы осуществляли по стандартной методике [3], которая была модифицирована нами, и заключалась в окрашивании матрикса красителем 1,9-диметил-метиленовым синим (DMMB), специфичным для компонентов матрикса, с последующей его экстракцией 96% этанолом и измерением оптической плотности при 540 нм [1]. Для визуализации матрикса биопленок ранее предлагались также красители конго красный (окрашивает только целлюлозу и целлюлозоподобные гликаны) [4] и альциановый синий (окрашивает кислые полисахариды) [5]. Однако, как по результатам цитируемой работы [3], так и по нашим данным (см. далее), DMMB обладает наибольшей избирательностью к компонентам матрикса и практически не окрашивает свободные от матрикса клетки бактерий.
1 Автор для корреспонденции (e-mail: plakunov@inmi.host.ru).
Целью данной работы является проверка возможности использования ряда микроскопических методов для визуализации матрикса биопленок и выявления различий в его формировании у изучаемых штаммов C. violaceum.
Для исследований методами фазово-контрастной (ФКЖ) и эпифлуоресцентной (ЭпиФM) (микроскоп Axio Imager. D1 Carl Zeiss объектив x40), лазерной интерференционной (ЛИM) и атомной силовой микроскопии ^CM), биопленки формировали на покровных стеклах. С этой целью стекла стерилизовали в чашках Петри сухим жаром, затем в чашки стерильно заливали по 10 мл среды LB (в случае мутанта CV026 добавляли 100 мкг/мл канамицина) и вносили инокулят: 50 мкл 24-часовой бактериальной культуры. Инкубировали в стационарных условиях при 28—29°С в течение 48 ч. Планктонную культуру сливали, стекла осторожно подсушивали фильтровальной бумагой, и биопленки фиксировали слабым нагреванием в пламени горелки. Для ФКЖ окрашивание проводили по стандартной методике красителем DMMB [3]. Для ЭпиФM — красителем DAPI [6]. Для ЛИM и АCM использовали неокрашенные препараты.
Для измерений методом ЛИM использовали микроскоп M^\-1, (ВНИИОФИ, Россия). Принцип метода и схема прибора подробно изложены в работах [7, 8].
АCM-изображения были получены с использованием комплекса NTEGRA SPECTRA (NT-MDT, Зеленоград, Россия) и программы NOVA (NT-MDT). Измерения проводили в полуконтактном режиме при помощи зонда NSG 10-A, средний модуль упругости 11.8 Н/м, средний радиус кривизны 10 нм. Область сканирования составляла 40 x 40 мкм (256 x x 256 точек), частота сканирования составляла 1 Гц. Обработку АCM и ЛИM изображений проводили с использование программы SPIP 6.0 (Image Metrology A/S, "Horsholm", Дания). Для определения латеральных размеров объектов в фазовых
WT
0
CV026
Рис. 1. Восстановление способности к образованию пигмента виолацеина у мутанта С. ую1асвыт СУ026 в присутствии штамма С. ую1асвыт WT (на поликарбонатных фильтрах на плотной среде ЬБ).
изображениях использовали Фурье-анализ усредненных профилей изображения, где размеры частиц определяли по наличию характерных частот в Фурье спектре. Параметр шероховатости (S) для АСМ и ЛИМ изображений рассчитывали по формуле:
M-1N-1
S = MN SS\ y )l' (!)
k=0 l=0
где: MN — номер точки по координатам х and у соответственно; к, l — индекс точки, г — амплитуда в точке Хк, уь
Диапазон высот (Sz) для АСМ изображений рассчитывали как разность высот между самой низкой и самой высокой точкой изображения.
SZ гтах ^min. (2)
Фрактальную размерность (f) для АСМ изображений рассчитывали по алгоритму, указанному в программе SPIP 6.0.
Электронномикроскопические исследования проводили на электронном микроскопе (JEM-100C, "Jeol", Япония) стандартными методами негативного контрастирования и ультратонких срезов. Препараты биопленок переносили на медные сеточки, покрытые формваровой пленкой ("Serva", Heidelberg, Германия), и окрашивали 2% фосфорновольфрамовой кислотой (рН 3.5). Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-3R и окрашивали 3% водным раствором уранилацетата. Препараты просматривали в микроскоп при увеличении 7—20 тыс.
Световая микроскопия. Характерной особенностью мутанта C. violaceum CV026 является неспособность к биосинтезу фиолетового пигмента ви-
олацеина в отсутствие экзогенных ацилгомосе-ринлактонов. Введение в среду М-бутаноил-, М-гексаноил- или М-октаноилгомосеринлакто-нов восстанавливает фенотип штамма дикого типа, о чем свидетельствует появление фиолетовой окраски клеток мутанта. Аналогичное действие оказывает присутствие в среде беспигментного (неспособного к синтезу виоласеина) штамма ^Т который способен выделять в среду М-гексаноилго-мосеринлактон. На рис. 1 представлен эффект, оказываемый штаммом WT на мутант СУ026, культивируемый на плотной среде ЬБ, за счет диффузии в среду ацилгомосеринлактонов.
На рис. 2 представлены типичные фотографии биопленок штамма С. уЫасвыт WT и его мутанта СУ026, полученные методом ФКМ после окрашивания ЭММБ.
Представленные фотографии свидетельствуют, что в соответствии с ранее высказанным предположением [1], биопленка мутанта характеризуется гораздо меньшим содержанием компонентов матрикса и преобладанием "оголенных", непогруженных в матрикс клеток и микроколоний (рис. 2б). Можно полагать, что отдельные овальные включения матрикса обусловлены локальной реверсией мутанта к дикому типу с восстановлением синтеза матрикса. Однако это предположение требует дальнейших исследований.
В зоне воздействия М-ацилгомосеринлактонов, диффундирующих в среду, наблюдается не только активация биосинтеза виолацеина (рис. 1), но и накопление компонентов матрикса, окрашиваемых ЭММБ (рис. 2г). Виолацеин содержится только в клетках и матрикс не окрашивает.
По сравнению со стандартной ФКМ метод ЛИМ обладает возможностью количественной
Рис. 2. ФКМ биопленок (выращенных на покровных стеклах) после окрашивания DMMB: C. violaceum WT (a), мутант CV026 при отсутствии в среде N-ацилгомосеринлактонов (б); биопленки мутанта CV026, выращенные на фильтрах (см. рис. 1): проба взята из зоны, не содержащей виолацеина (в); проба взята на границе зоны, содержащей виолацеин (г).
оценки величины оптической разности хода объекта (ОРХ), что позволяет значительно расширить и автоматизировать анализ получаемых изображений. При помощи ЛИМ получают фазовые изображения распределения величины ОРХ в каждой точке объекта. Особенности использования ЛИМ для различных микробиологических объектов приведены в работе [7]. Измеряемая при помощи ОРХ величина в каждой точке плоскости объекта представляет из себя сумму произведений показателя преломления на толщину различных оптических сред в этой точке (среды, клеток и т.д.) [8]:
ОРХ = (ВД + «2^2 +... + Пп1п) - пт1, (3)
где г и п — толщина и показатель преломления оптической среды соответственно.
Таким образом, фазовые изображения пленок можно интерпретировать как двумерную проекцию трехмерной структуры биопленки, а неровности объектов будут обусловлены либо геометрией пленки (неровности рельефа) и/или (что более вероят-
но) различием в структуре (например, более высоким значением показателя преломления клеток или наличием пустот).
Типичные фазовые изображения биопленок штаммов WT и СУ026 приведены на рис. 3.
Перепад величины ОРХ для штамма WT в среднем более чем в 9 раз превышает аналогичную величину для штамма СУ026, что, по-видимому, определяется различиями в толщине исследуемых биопленок. Для анализа изображений представляется наиболее логичным оценить латеральные размеры объектов, среднюю толщину образцов и шероховатость объектов (как это принято, например, в материаловедении для оценок характеристик пленок). Характерные размеры для штаммов WT и СУ026 приведены в табл. 1.
Латеральные размеры объектов, измеренных при помощи ЛИМ, составляют 10—15 мкм, что значительно больше размеров одной бактерии, однако такой размер соответствует размеру микроколоний этих бактерий. Таким образом, внут-
(а)
У, мкм
140 120 10' 80 60 40
20 V
т-1-1-г
20 40 60 80 100 120 140 160 180 X, мкм (б)
У, мкм
140 120
100 80 60 40
20
X, нм
600 400 200
нм
500
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 X, мкм
Рис. 3. Типичные фазовые изображения биопленок С. ую1асеыт WT (а) и мутанта С. ую1асеыт СУ026 (б).
ренние структуры, оцениваемые ЛИМ, по-видимому, являются микроколониями клеток, представляющими из себя компактные скопления клеток и матрикса.
Шероховатость (изменение высоты от среднего) у СУ026 и WT различается, но, скорее всего, это связано с различной исходной толщиной пленки (чем больше толщина, тем больше шероховатость).
Соответственно, большее значение шероховатости и средней толщины образцов в случае штамма WT обусловлено большим количеством матрикса внутри биопленки этого штамма.
Существенные различия в строении
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.