МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 6, с. 990-998
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.18;577.151.33
ВКЛАД АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В БАКТЕРИЦИДНОЕ ДЕЙСТВИЕ ХИНОЛОНОВ - ИНГИБИТОРОВ ДНК-ГИРАЗЫ
© 2014 г. В. Ю. Котова, А. С. Миронов, Г. Б. Завильгельский*
Государственный научный центр "ГосНИИгенетика", Москва, 117545 Поступила в редакцию 21.05.2014 г. Принята к печати 16.06.2014 г.
Антибиотики хинолоны ингибируют ДНК-гиразу, но индуцируемая в результате этого деградация хромосомной ДНК определяется сложным процессом совместного действия хинолона и гидроксил-радикала OH'. Для количественной оценки уровня стрессовых реакций в бактериальной клетке и временной зависимости этих реакций в настоящей работе использованы специфические индуцируемые lux-биосенсоры — бактерии Escherichia coli, содержащие гибридные плазмиды pColD'::lux; pSoxS'::lux; pKatG'::lux. Показано, что хинолоны (налидиксовая кислота, норфлоксацин) индуцируют в клетках E. coli SOS-ответ и
окислительный стресс с образованием супероксид-аниона O-. Определены основные параметры SOS-ответа и окислительного стресса в зависимости от концентрации хинолонов. Образование супероксид-
аниона O— происходит практически одновременно с SOS-ответом. Мутантный штамм E. colisodAsodB, не содержащий активных форм супероксиддисмутаз SodA и SodB, характеризуется повышенной резистентностью к хинолонам по сравнению с клетками дикого типа. Бактерицидное действие хинолонов, взятых в высоких концентрациях (налидиксовая кислота — >20 мкг/мл; норфлоксацин — >500 нг/мл), частично связано с превращением супероксид-аниона в пероксид водорода (H2O2), проводимого су-пероксиддисмутазами SodA и SodB, c последующей реакцией Фентона и формированием токсичного гидроксил-радикала OH'. При низких концентрациях хинолонов (налидиксовая кислота <20 мкг/мл; норфлоксацин <500 нг/мл) вклад активных форм кислорода в их антимикробный эффект практически отсутствует.
Ключевые слова: хинолон, фторхинолон, активные формы кислорода, lux-биосенсор.
ROLE OF REACTIVE OXYGEN SPECIES IN THE BACTERICIDAL ACTION OF QUINOLONES — INHIBITORS OF DNA GYRASE, by V. Yu. Kotova, A. S. Mironov, G. B. Zavilgelsky* (State Research Center "GosNIIgenetika", Moscow, 117545 Russia; *e-mail: zavilgel@genetika.ru). Quinolone antibiotics inhibit DNA gyrase, but the induced degradation of chromosomal DNA is determined by a complex process ofjoint action quinolones and hydroxyl radical OH'. To quantify the level of stress responses and their time dependence in bacterial cells the induced specific lux-biosensors — the bacterium Escherichia coli, containing hybrid plas-mids pColD':: lux; pSoxS':: lux; pKatG':: lux were used in this study. It is shown that quinolones (nalidixic acid, norfloxacin) induce SOS-response and oxidative stress with the formation of superoxide anion O— in E. coli cells. The main parameters of SOS-response and oxidative stress, which depend on the quinolone concentration, are determined. Formation of superoxide anion O— occurs almost simultaneously with the SOS-response. The mutant strain of E. coli sodA sodB, which do not contain active forms of superoxide dismutases SodA and SodB, is characterized by an increased resistance to quinolones as compared to the wild type cells. At high concentrations of quinolones (nalidixic acid — >20 ^g/mL; norfloxacin — >500 ng/mL) their bactericidal effect is partially caused by conversion of the superoxide anion to hydrogen peroxide H2O2, conducted by superoxide dismutases SodA and SodB, which is followed by the Fenton reaction and the formation of toxic hydroxyl radical OH'. At low concentrations of quinolones (nalidixic acid — <20 ^g/mL; norfloxacin — <500 ng/mL), the role of active oxygen species in the antimicrobial effect is practically nonexistent.
Keywords: quinolone, fluoroquinolone, reactive oxygen species, lux-biosensor. DOI: 10.7868/S002689841406010X
* Эл. почта: zavilgel@genetika.ru
Хинолоны, а также фторхинолоны — синтетические производные налидиксовой кислоты, относятся к группе антибиотиков с широким спектром действия и высокой активностью. Хиноло-ны успешно применяют при туберкулезе, так как они эффективно подавляют размножение Mycobacterium tuberculosis [1, 2]. Хинолоны ингибируют ДНК-гиразу грамотрицательных бактерий, один из ключевых ферментов, участвующих в репликации бактериальной хромосомы, на стадии формирования эфирной связи тирозил-фосфат, в результате чего в основной цепи ДНК образуется разрыв. Этот этап бактериостатичен и обратим. Бактерицидное (летальное) необратимое действие хинолонов связано с последующим процессом накопления одно- и двухцепочечных разрывов в ДНК [3], оно определяется сложным процессом совместного действия хинолона и гидроксил-ра-дикала OH' [4—6]. Ключевую роль гидроксил-ра-дикал играет в летальном эффекте и других групп антибиотиков (ß-лактамных, аминогликозидных и др.) [7—12]. Однако недавно опубликованы работы, в которых роль активных форм кислорода (АФК) в летальном эффекте бактерицидных антибиотиков подвергается сомнению, так как результаты, полученные при выращивании бактерий в анаэробных условиях, были такими же, как и при их культивировании в аэробных условиях [13, 14].
В разрешении данной проблемы принципиально важен ответ на вопрос о количестве АФК, синтезируемых в бактериальной клетке, обработанной хинолонами. При росте необработанных хинолонами бактерий в аэробных условиях АФК образуются как побочный продукт активности ферментов дыхательной системы. Однако системы защиты от пероксида водорода (каталазы KatG и KatE, гидроксилпероксидаза AhpC) и супероксид-аниона (супероксиддисмутазы MnSo-dA, FeSodB, CuSodC) обеспечивают очень низкий базальный уровень АФК, не способный повредить ДНК, тем более что клетка содержит специальные ферменты, репарирующие окисленные азотистые основания в ДНК.
В настоящей работе для определения временной зависимости развития стрессовых реакций и количественной оценки их уровня в бактериальной клетке использованы специфические индуцируемые lux-биосенсоры — бактерии Escherichia coli, содержащие гибридные плазмиды: pKatG'::lux (для детекции пероксида водорода), pSoxS'::lux (для детекции супероксид-аниона) и pColD'::lux (для детекции повреждений в бактериальной хромосоме). В качестве генов-репортеров используется кассета генов luxCDABE Photorhabdus luminescens, кодирующих люциферазу (гены luxAB) и редуктазу (гены luxCDE), осуществляющую синтез тетрадеканаля — субстрата люциферазы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактериальные штаммы и плазмиды. В работе использовали следующие штаммы: E. coli Kl 2: MG1655 F- ilvG rfb-50 rph-1; MC1061 F- araD139 A(ara leu)7697AlacX74thigalU galKhsdRmcrBrpsL; TG-1 thi relA supE44 hsdR17 hsdM Alac-proAB) [F'traD36 proAB lacPZD AM15]; AB 1157 F- thr-1 leu-6 proA2 his-4 thi-1 argE3 lacY1 galK2 ara14xyl-5 mtl-1 tsx-33 rpsL31 supE44; E. coli QC868 F- leu6 thrA1 proA2 thi-1 lacY1 tonA1 rpsL31 supE44 hsdR-Smr; E. coli QC869 F- leu6 thrA1 proA2 thi-1 lacY1 tonA1 rpsL31 supE44 hsdR- sodA25 Cmr Smr; E. coli QC871 F- leu6 thrA1 proA2 thi-1 lacY1 tonA1 rpsL31 supE44 hsdR.- sodA25 sodB2 Cmr Kanr Smr [15].
Вектор pTZ57R фирмы "Fermentas", вектор pDEW201 получен от T.K. Van Dyk (США).
Фрагменты ДНК, содержащие промоторы PsoxS, Pcda и соответствующие регуляторные участки, получены при помощи ПЦР-амплификации нуклеотидных последовательностей из плазмиды pColD-CA23 и генома E. coli K12 MG1655 с использованием соответствующих праймеров. На первом этапе ПЦР-продукты были клонированы в Т-векторе pTZ57R. Далее фрагменты ДНК, фланкированные сайтами рестрикции EcoRI и BamHI, встраивали по указанным сайтам в бес-промоторный вектор pDEW201 (oricolE, ген-маркер bla), в котором они были транскрипционно слиты с генами-репортерами luxCDABE P. luminescens. Сконструированные гибридные плазмиды вводили в клетки различных штаммов E. coli K12. Выделение плазмидных ДНК, рестрикцию, лиги-рование фрагментов ДНК, трансформацию клеток проводили согласно [16].
Lux-биосенсоры для детекции хинолонов. В настоящей работе хинолоны детектировали с использованием lux-биосенсоров на основе клеток E. coli, содержащих гибридные плазмиды pColD'::lux, pKatG'::lux и pSoxS'::lux. В плазмиде pColD'::lux промоторно-операторная область перед геном cda (фрагмент ДНК выделен из плазмиды pColD-CA23) транскрипционно слита с кассетой генов luxCDABE P. luminescens. В плазмиде pKatG'::lux промоторно-операторная область перед геном katG (фрагмент ДНК из генома бактерий E. coli MG1655) транскрипционно слита с кассетой генов luxCDABE P. luminescens. В плазмиде pSoxS'::lux промоторно-операторная область перед геном soxS (фрагмент ДНК выделен из генома E. coli MG1655) транскрипционно слита с кассетой генов luxCDABE P. luminescens.
Питательные среды и условия роста. Бактерии растили в бульоне Луриа-Бертани (LB), содержащем 100 мкг/мл ампициллина или 40 мкг/мл ка-намицина. Клетки растили с аэрацией при 30°C до ранней экспоненциальной фазы.
100000 Г
В В
о К
и
Я Я о Я о (U
Я
и
10000
1000
100
2 10000 ч
13
о о я <ч
и
о Я
В я К
1000
100 -
10 -
60 120 Время, мин
240
Рис. 1. Реакция биосенсоров E. coli QC868 sod+ (pSoxS'::lux) и E. coli QC871 sodAsodB (pSoxS'::lux) на паракват. Зависимость индукции биолюминесценции lux-биосенсоров E. coli QC868 sod+ (pSoxS'::lux) (а) и двойного мутанта E. coli QC871 sodA sodB (pSoxS'::lux) (б) от времени инкубации в среде, содержащей паракват в концентрации 10,0, 100, 300 мкМ и 1.0 мМ. Здесь и на рис. 2—6 по оси ординат отложена интенсивность биолюминесценции в относительных единицах (ОЕ). Концентрации параквата: 1 - 0.0 мкМ, 2 - 1 мМ, 3 - 300 мкМ, 4 - 100 мкМ, 5 - 10 мкМ.
Ферменты и химические вещества. Все использованные препараты имели аналитическую чистоту. В качестве индукторов использовали антибиотики: налидиксовую кислоту, норфлоксацин, тетрациклин, ампициллин фирм "Sigma Chemical Co" (США), "Merk" (Германия), "Biopharm" (Россия). Ферменты для работы с ДНК получены от "Fermentas" (Литва). Все тест-растворы готовили непосредственно перед использованием.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.