МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 5, с. 542-551
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.355.3
ВКЛАД БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛА В СТАБИЛИЗАЦИЮ СТРУКТУРЫ ПРИЦЕНТРОВЫХ И ПЕРИФЕРИЙНЫХ СВЕТОСОБИРАЮЩИХ КОМПЛЕКСОВ ИЗ ПУРПУРНЫХ ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ
© 2013 г. А. А. Соловьев1, Ю. Е. Ерохин
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино Поступила в редакцию 14.02.2013 г.
Исследованы основные закономерности процесса феофитинизации бактериохлорофилла (БХл) при низких значениях рН в прицентровом (ЬН1) и периферийном (ЬН2) светособирающих комплексах, а также в ансамбле реакционного центра (ЯС) с ЬН1-комплексом. Выявлена выраженная стадийность разрушения нативных форм БХл в ЬН1-комплексе и его ансамбле с ЯС. Это проявляется в возникновении и повышении интенсивности поглощения полосы мономерного БХл с ее последующим переходом в полосу поглощения мономерного бактериофеофитина (БФео), переходящую в свою очередь в полосу агрегированного БФео. В отличие от ЬН1-комплекса, для ЬН2-ком-плекса не удается наблюдать в качестве промежуточного продукта мономерный БХл. В спектрах видно образование полосы поглощения мономерного БФео, но его значительного накопления не происходит, поскольку агрегация БФео протекает очень быстро по сравнению с таковой в ЬН1-ком-плексе и ансамбле ЯС-ЬН1. С помощью электрофореза в ПААГ показано, что феофитинизация БХл в ЬН2-комплексе сопровождается разрушением устойчивой цилиндрической структуры этого комплекса с появлением характерных фрагментов, состоящих из а- и Р-пептидов и несущих мономерный БФео, и агрегатов а-пептидов, несущих агрегаты БФео. В отличие от ЬН2-комплекса, феофитинизация БХл в ЬН1-комплексе не вызывает его фрагментации. Это свидетельствует о различном типе стабилизации структур ЬН1- и ЬН2-комплексов. В ЬН2-комплексе координация ионов бактериохлорофилла консервативными остатками гистидинов а- и Р-полипептидов вносит основной вклад в поддержание его цилиндрической структуры. По всей видимости, устойчивость ЬН1-комплекса основана, в первую очередь, на весьма специфических гидрофобных взаимодействиях между поверхностями отдельных полипептидных цепей, поскольку наличие водородных связей приводит к автономии каждой из аРБХл2-субъединиц, но не к стабилизации структуры ЬН1-ком-плекса в целом.
Ключевые слова: спектры поглощения, электрофорез, бактериальный фотосинтез, светособираю-щие комплексы (ССК), Allochromatium minutissimum, Rhodospirillum rubrum.
DOI: 10.7868/S0026365613050133
Процессы преобразования энергии света в энергию состояния с разделенными зарядами осуществляется в реакционных центрах (RC) фотосинтеза. Однако без светособирающих комплексов (ССК) фотосинтез был бы малоэффективен. ССК увеличивают светосбор и согласуют по времени процессы сбора квантов и их "переработки" в RC. Все виды пурпурных бактерий содержат прицентровый ССК (LH1), непосредственно направляющий энергию возбуждения на RC. Большинство видов пурпурных бактерий содержат также периферические ССК (LH2), передающие энергию возбуждения на RC через LH1-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: alex_1_i@mail.ru).
комплекс. В настоящее время ЬН1- и ЬН2-ком-плексы достаточно подробно изучены со структурно-функциональной и спектральной точек зрения. Для некоторых ЬН2-комплексов установлена полная пространственная структура, взаиморасположение бактериохлорофилла (БХл), ка-ротиноидов и пептидов [1, 2]. Структура ЬН1-комплексов с высоким разрешением до сих пор не получена [3]. Однако, поскольку установлено, что пептиды ЬН1- и ЬН2-комплексов гомологичны, а структуры этих комплексов построены по универсальному блочному принципу, для при-центровых комплексов оказалось возможным построить разумные структурные модели с использованием структур периферических комплексов
[4, 5]. Оба комплекса состоят из субъединиц, образованных гетеродимерами а- и Р-полипептид-ных цепей и связанных с ними молекул БХл и ка-ротиноидов [6, 7]. Эти субъединицы агрегируют с образованием цилиндрических структур, стабилизированных пигмент-пигментными взаимодействиями порфириновых колец БХл, координационной связью Mg с пептидами, а также водородными связями, ван-дер-ваальсовыми и гидрофобными взаимодействиями пептидов и полиеновых цепочек каротиноидов и фитолов БХл. Цепи а- и Р-полипептидов содержат от 40 до 70 аминокислотных остатков и обладают "трехдо-менной" структурой. В каждой из этих полипептидных цепей полярные N- и C-терминальные участки расположены, соответственно, на цито-и периплазматической стороне мембраны, а центральный гидрофобный участок образует а-спи-раль, которая расположена внутри мембраны перпендикулярно к ее поверхности и содержит консервативные остатки His, лигандирующие ионы Mg2+ молекул БХл. В мембране а-спирали а-полипептидов образуют плотный внутренний цилиндр, который стабилизирован взаимодействиями между спиралями; а-спирали Р-поли-пептидов образуют более рыхлый внешний цилиндр, в котором расстояния между полипептидами не допускают прямых Р-Р-взаимодействий. Между спиральными участками а- и Р- полипептидов непосредственное взаимодействие имеет место только на N- и C-концах. Внутри погруженных в мембрану частей этих спиралей взаимодействие между ними опосредовано только через молекулы пигментов и связанной воды. Порфи-риновые кольца молекул БХл находятся внутри мембраны перпендикулярно плоскости ее поверхности, ближе к периплазматической стороне между внутренним и внешним цилиндрами, сформированными а- и Р-полипептидами, и образуют единый экситонный ансамбль, поглощающий при 850 или 880 нм для LH2- и LHl-ком-плексов соответственно. Центральные ионы Mg2+ этих молекул БХл лигандированы консервативными остатками гистидинов а- и Р-полипепти-дов. В LH2-комплексaх имеются, кроме того, молекулы БХл, поглощающие при 800 нм, расположенные между цепями Р-полипептидов ближе к цитоплазматической стороны мембраны, с плоскостями порфириновых колец, параллельными плоскости мембраны. Их центральные ионы Mg2+ лигандированы N-концевыми карбоксилирован-ными метионинами а-полипептидов [6]. Недавно проведенные компьютерные расчеты показывают, что наблюдаемые различия в степени оли-гомеризации в LH2-комплексaх в значительной степени обусловлены различиями в углах взаимодействия между поверхностями соседних субъединиц в трансмембранной области [8]. Кольцо
ЬИ2-комплекса из Rhodopseudomonas acidophila (Rhodoblastus acidophilus) содержит 9 субъединиц [1], в то время как ЬИ2-комплекс из Phaeospirillum molischianum состоит из 8 субъединиц [2]. Однако в клетках разных пурпурных бактерий количество субъединиц в ЬИ2-комплексах может сильно варьировать [6, 9—11]. Считается, что теоретические расчеты, предложенные ранее [8], всецело совместимы с наблюдаемой гетерогенностью, поскольку для модификации олигомерной структуры ЬИ2-комплекса требуется мало энергии [12]. Цилиндрическая структура ЬИ1-комплексов, образованная повторением 12—16 субъединиц, во многих видах пурпурных бактерий усложняется наличием дополнительного компонента — так называемого PufX-белка. При этом часто наблюдается димеризация ЬИ1-комплексов [7]. Однако в некоторых пурпурных бактериях ЬШ-комплексы не содержат PufX-белка. Так, цилиндрическая структура ЬИ1-комплекса из Rhodospirillum (Rsp.) rubrum образована повторением 16 субъединиц [13]. В отличие от ЬИ2-комплексов, внутренний объем цилиндров ЬИ1-комплексов заполнен RC — по одному RC на каждую полость. В настоящее время очень мало известно о сборке ССК и их ансамблей с RC in vivo. Считается, что эту сборку контролируют специализированные энзиматиче-ские структуры, гены которых локализованы в кластере генов фотосинтеза и puc-опероне. Неизвестно, однако, каким образом эти факторы вовлечены в сборку фотосинтетических единиц пурпурных бактерий. Этот вопрос остается важным предметом исследований ближайшего будущего [12]. В изучении формирования ССК мощным инструментом является направленный мутагенез [14]. Другим подходом является конструирование функциональных модельных ССК, в которых их компоненты целенаправленно заменяются в экспериментах по самосборке in vitro [15]. Способность центрального иона Mg2+ (Б)Хл координационно взаимодействовать с аминокислотными остатками уже давно рассматривается как решающий фактор в сборке (Б)Хл-белков. Показано, например, что мутанты Rhodobacter sphaeroides, у которых а И is или ß ffis, лигандирующие Mg2+ бактериохлорофилла В850 в а- и ß-полипепти-дах, заменены на Asn, не содержат ЬИ2-комплек-са [16]. Исследования феофитинизации натив-ных форм БХл и агрегации образующегося бакте-риофеофитина (БФео) и анализ фрагментов, образующихся в ходе этих процессов, показали, что нарушение координационных связей Mg2+ с гистидиновыми остатками разрушает исходную упорядоченную макроструктуру ЬИ2-комплекса из Allochromatium (Alc.) minutissimum [17].
Представляло интерес сравнить устойчивость такой структуры ЬИ2-комплекса с более протяженной, разрыхленной структурой ЬИ1-ком-
плекса, включающей 16 субъединиц, имея в виду, что универсальный остов обеих этих структур состоит из кольцевых агрегатов молекул БХл, охваченных сильным экситонным взаимодействием. Поскольку выделить LHl-комплекс из Alc. minu-tissimum не представляется возможным, подходящим объектом для решения этой задачи является LHl-комплекс из несерной пурпурной бактерии Rsp. rubrum, так как он представляет собой замкнутую цилиндрическую структуру [13], как и LH2-комплекс. В качестве воздействия, как и в нашей предыдущей работе [17], была выбрана феофитинизация БХл при действии низких pH.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактерии Alc. minutissimum и Rsp. rubrum (штамм 1R) КМ МГУ выращивали в видоизме-неннных средах Ларсена [18] и Ормерода [19] соответственно при температуре 30°C и непрерывном освещении (интенсивность света 90 Вт/м2). Клеточную биомассу собирали в начале стационарной фазы.
Хроматофоры выделяли центрифугированием после озвучивания клеток с применением ультразвукового генератора УЗГ13-0.1/22 при 22 кГц [20]. Осадки ресуспендировали в 0.05 М буфере трис-HCl, pH 8.0.
Выделение LH2-комплекса и ансамбля RC-LH1 из Alc. minutissimum, реэлектрофорез на-тивных ком
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.